李桂湖

宮頸癌是一種發(fā)生率較高的婦科惡性腫瘤疾病，其發(fā)生、發(fā)展與癌基因激活、抑癌基因失活之間存在密切的相關(guān)性關(guān)系[1]。Survivin是目前已知生理功能最為強(qiáng)大的凋亡抑制因子，可有效抑制Caspase-3、Caspase-7的活性功能，最終抑制細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[2]。野生型p53基因在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、血管組織形成和DNA生理代謝等多個過程中均發(fā)揮著重要的作用，但其出現(xiàn)異常突變可使得正常生理功能喪失，具有癌基因的生理學(xué)活性作用，最終促進(jìn)腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展[3,4]。目前關(guān)于Survivin、p53與宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的臨床研究相對較少，因此本研究擬觀察兩者的表達(dá)情況，并判斷其是否可作為早期診斷宮頸癌前病變的生物標(biāo)志，進(jìn)而評估疾病預(yù)后情況。

對象與方法

1.對象：2013年5月—2015年12月本院收治女性宮頸疾病患者195例，其中慢性宮頸炎40例，宮頸上皮內(nèi)瘤變83例(CINⅠ期26例，CINⅡ期27例，CINⅢ期30例)，宮頸癌72例，均經(jīng)病理組織檢查均已確診。本研究方案已通過院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

2.實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：兔抗人多克隆Survivin及抗體(工作液濃度1:100)、鼠抗人單克隆p53抗體(工作液濃度1:200)購自美國Santa Cruz公司；Elivision免疫組化試劑盒購自北京金橋生物技術(shù)有限公司，羊抗兔、羊抗鼠二抗及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

3.實(shí)驗(yàn)方法：采用免疫組織化學(xué)(Elivision二步法)法檢測Survivin、p53在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達(dá)情況。采用10%甲醛溶液固定處理所有組織標(biāo)本，石蠟包埋后連續(xù)切片，切片厚度為5 μm，梯度乙醇溶液水化處理，隨后高溫高壓環(huán)境下修復(fù)作用3 min，采用3%雙氧水溶液孵育作用10 min，PBS緩沖液洗滌組織切片3次，加入適量Survivin或p53一抗，室溫環(huán)境條件下孵育作用2 h，隨后加入適量二抗工作液，室溫環(huán)境條件下孵育作用1 h，PBS緩沖液洗滌組織切片3次，DAB顯色劑顯色處理，最后使用蘇木精溶液復(fù)染，封片后鏡下觀察，整個實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格遵守說明書進(jìn)行操作。

4.染色結(jié)果判斷方法：普通顯微鏡下觀察組織切片的顯色反應(yīng)，Survivin陽性表現(xiàn)為細(xì)胞漿中出現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒，p53陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核中出現(xiàn)淺黃色或棕黃褐色顆粒，高倍鏡下隨機(jī)選擇5個視野，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)占整個細(xì)胞的百分比予以記分。0分：陽性細(xì)胞數(shù)百分比<5%；1分：5%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：陽性細(xì)胞數(shù)百分比>75%。根據(jù)著色強(qiáng)度予以記分，1分：淡黃色，2分：黃色，3分：棕黃色。兩者得分乘積即為陽性表達(dá)強(qiáng)度：0分：(-)，1～4分：(+)，5～8分：(++)，9～12分：(+++)。

5.統(tǒng)計學(xué)處理：均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，采用Spearman法分析兩者之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.Survivin在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達(dá)：Survivin在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ期和宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為7.5%，30.8%，44.4%，60.0%，77.8%，呈依次升高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1及圖1。

圖1 Survivin在不同宮頸病變的表達(dá) A.宮頸癌組織；B.宮頸上皮內(nèi)瘤變；C.慢性宮頸炎

2.p53在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達(dá)：p53在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ期和宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為5.0%，23.1%，37.0%，53.3%，72.2%，呈依次升高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2及圖2。

圖2 p53在不同宮頸病變的表達(dá) A.宮頸癌組織；B.宮頸上皮內(nèi)瘤變；C.慢性宮頸炎

3.Survivin、p53與宮頸癌的臨床病理關(guān)系：宮頸癌Survivin表達(dá)陽性率在FIGO分期、間質(zhì)浸潤深度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移方面與差異；宮頸癌p53表達(dá)陽性率則在淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型及分級方面有差；宮頸癌鱗癌與腺癌Survivin表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，宮頸癌鱗癌與腺癌p53表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表1 Survivin在3種組織中的表達(dá)[例(%)]

注：與慢性宮頸炎比較，*P<0.05；與CINⅠ期比較，#P<0.05；與CINⅡ期比較，▲P<0.05；與CINⅢ期比較，○P<0.05

表2 p53在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達(dá)

注：與慢性宮頸炎比較，*P<0.05；與CINⅠ期比較，#P<0.05；與CINⅡ期比較，▲P<0.05；與CINⅢ期比較，○P<0.05

表3 Survivin、p53與宮頸癌的臨床病理關(guān)系[例(%)]

注：與鱗癌、Ⅰ期、≤淺肌層、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，*P<0.05；與Ⅱ期比較，#P<0.05

討論

Survivin在調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡現(xiàn)象等方面起到相當(dāng)重要的作用，可直接阻斷Caspase-3、Caspase-7的生物學(xué)效應(yīng)作用，同時還可有效抑制多聚ADP核糖聚合酶的生物學(xué)活性功能，進(jìn)而抑制細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，與多數(shù)腫瘤疾病的產(chǎn)生和預(yù)后有著密切的相關(guān)性[5]。細(xì)胞研究結(jié)果顯示[6]，Survivin表達(dá)水平過高可使得cyclin D1、C-myc表達(dá)水平顯著性增高，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中Survivin陽性表達(dá)率(80.6%)明顯高于慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，此結(jié)果提示Survivin在宮頸癌組織中的基因表達(dá)明顯上調(diào)，使得細(xì)胞生長出現(xiàn)異常紊亂，有利于腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲周圍正常組織，因此，可知Survivin可作為早期診斷宮頸癌的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)志物[7]。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，Survivin陽性表達(dá)率在FIGO分期、間質(zhì)浸潤

深度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移方面有差異，提示Survivin表達(dá)水平越高，則臨床分期及病灶浸潤深度越嚴(yán)重，更易侵襲周圍正常組織并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致術(shù)后生存期明顯縮短，即Survivin表達(dá)水平過高預(yù)示宮頸癌患者預(yù)后情況較差。

p53與細(xì)胞周期蛋白(cyclins)相互結(jié)合可形成特異性的復(fù)合體，進(jìn)而有效抑制依賴cyclins的相關(guān)激酶的生物學(xué)活性功能，導(dǎo)致細(xì)胞在G1期出現(xiàn)停滯或誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，最終清除可能發(fā)生癌變的異常細(xì)胞[8-9]。當(dāng)p53基因出現(xiàn)異常突變時，可使得穩(wěn)定蛋白質(zhì)難以抑制細(xì)胞異常增殖過程，從而促進(jìn)細(xì)胞呈惡性轉(zhuǎn)化，使得p53基因由抑癌基因轉(zhuǎn)為原癌基因[10]。但目前p53在宮頸癌患者預(yù)后情況方面的預(yù)測價值尚缺少相關(guān)報道，本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織p53陽性表達(dá)率明顯高于其他組織，提示p53基因突變與宮頸癌疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切的相關(guān)性。此外研究還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌p53表達(dá)陽性率在淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型及分級方面有差異，提示p53表達(dá)與宮頸癌的組織學(xué)類型、分級有一定相關(guān)性，且在淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及病情預(yù)后方面具有一定預(yù)測價值。

綜上所述，Survivin、p53與宮頸癌疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，尤其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系更為密切，此外前者還與臨床分期和病灶侵襲周圍正常組織有關(guān)，后者則與腫瘤惡性程度有關(guān)，均可作為檢測宮頸癌前病變的生物標(biāo)志，并用于判斷宮頸癌患者的預(yù)后情況。

(圖1、圖2見封底)

1 惠燕,黃利鳴,葉紅.survivin在人宮頸癌前病變和宮頸浸潤癌組織中的定量分析及其臨床價值的評估.腫瘤防治研究,2008,35:39-42.

2 盧洪勝,甘梅富,張艷,等.宮頸癌前病變及宮頸癌組織Survivin和p16INK4A及p53表達(dá)的研究.中華腫瘤防治雜志,2009,16:810-813.

3 王曉英,黃永宏,張宏偉,等.Ki67、p53、Survivin在宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸炎中的表達(dá)及意義.山東醫(yī)藥,2010,50:88-89.

4 雷蕾,葉斌,王西川.p16、p53和Ki67在宮頸癌中的表達(dá)及其臨床意義.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志,2014,11:123-125.

5 朱燕,楊其昌,劉宏斌,等.Survivin、bcl-2及p53蛋白在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達(dá)及意義.實(shí)用癌癥雜志,2008,23:138-140.

6 馬寧,李小姝,張嬋麗,等.Survivin與MIF在宮頸癌組織中的表達(dá)及意義.腫瘤基礎(chǔ)與臨床,2008,21:388-390.

7 張晶,王宇娟,霍俊玲,等.宮頸癌組織中Survivin的表達(dá)及臨床意義的系統(tǒng)評價.中國循證醫(yī)學(xué)雜志,2014,14:216-224.

8 郭建華,伍亞云,劉俊宏.p53、p16和C-myc基因表達(dá)在宮頸癌早期診斷中的價值.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,22:2518-2523.

9 王喜梅,羅光霞,張雪梅,等.宮頸腺癌HPVl8/18感染與ki67、p53蛋白表達(dá)的關(guān)系.實(shí)用癌癥雜志,2009,24:22-25.

10 于永亮,尚亞非.p53蛋白表達(dá)對結(jié)腸癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)后的關(guān)系.實(shí)用醫(yī)技雜志,2007,14:5014-5015.