劉永斌 夏利平 裴林國 袁超 汪暉

生命早期的發(fā)育狀況對于機(jī)體代謝的終身影響乃至對成年期發(fā)生某些慢性疾病的重要意義，日益受到重視。早在1989年，英國流行病學(xué)學(xué)家Barker教授[1]就提出了“成人疾病的胎兒起源(fetal origins of adult disease)”假說。流行病學(xué)研究顯示，出生體重的差異來源于62%的宮內(nèi)環(huán)境因素、20%的母體基因因素和18%的胎兒基因因素。學(xué)者利用人群流行病學(xué)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法對Barker假說進(jìn)行了驗(yàn)證，并提出不單是胎兒期營養(yǎng)狀況會(huì)對健康產(chǎn)生長久影響，嬰幼兒期、兒童少年期甚至青壯年期的營養(yǎng)均會(huì)對其后期的健康產(chǎn)生一定程度的影響[2-3]。研究表明，85%～90%的宮內(nèi)生長遲緩(intrauterine growth retardation, IUGR)胎兒在出生后2年發(fā)生追趕式生長，且有追趕式生長者更易于發(fā)生胰島素抵抗(insulin resistance, IR)[4]。大量流行病學(xué)研究表明，IUGR、追趕式生長及伴隨而來的肥胖與后期代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)、心血管疾病、2型糖尿病和非酒精性肝病發(fā)生密切相關(guān)[5-8]。

研究發(fā)現(xiàn)，孕期尼古丁、咖啡因和乙醇暴露皆可引起胎兒母源性糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)過暴露和下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)軸功能低下，IUGR子代出生后HPA軸呈低基礎(chǔ)活性和高應(yīng)激敏感性改變，并伴有GC依賴的糖脂代謝改變，提出了外源物的“宮內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌代謝編程”機(jī)制[9-11]。研究表明，母體GC通過胎盤屏障進(jìn)入雌性胎兒的量比進(jìn)入雄性胎兒的量更大，提示了母體應(yīng)激對雌性后代HPA軸的影響比雄性后代更大[12]。本研究通過觀察高脂飲食(模擬高營養(yǎng)狀態(tài))、慢性應(yīng)激(模擬高社會(huì)壓力)及孕期尼古丁暴露(prenatal nicotine exposure, PNE)對子代雌鼠成年后的影響，從而進(jìn)一步探討IUGR子代MS易感的宮內(nèi)起源機(jī)制，為特殊群體的優(yōu)生優(yōu)育和生后的合理干預(yù)提供更多的理論依據(jù)。

對象與方法

一、對象

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：未孕SPF級Wistar大鼠，雌性體重200～240 g，雄性體重260～300 g，購于湖北省疾病預(yù)防中心(合格證號：SCXK(鄂) 2007—2009，中國湖北)。

2.主要試劑：尼古丁(CAS. NO.54-11-5)購于中國濰坊三強(qiáng)集團(tuán)公司；大鼠腎上腺激素釋放激素(adrenocorticotropin-releasing hormone, ACTH)試劑盒購于北京北方生物研究所；大鼠皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT)試劑盒購于美國R&D公司；胰島素ELISA試劑盒購于瑞典Mercodia公司；葡萄糖氧化酶法試劑盒購于上海名典生物工程有限公司；1型11β-羥類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1, 11β-HSD1)、糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)、鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor, MR)及內(nèi)對照磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)引物、甘油三酯(triglyceride, TG)和總膽固醇(total cholesterol, TCH)試劑盒均購于上海生工生物工程技術(shù)有限公司；高密度脂蛋白-膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白-膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)試劑盒購于浙江創(chuàng)業(yè)生物有限公司。逆轉(zhuǎn)錄 PCR試劑購于大連TaKaRa公司；Applied Biosystems Step One實(shí)時(shí)定量PCR儀和PCR試劑盒購于美國Applied Biosystems公司。

二、方法

1.處理方法：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，于每晚6點(diǎn)按照雌鼠：雄鼠=2:1合籠，次晨陰道分泌物涂片鏡檢見精子者記為孕0天(gestational day 0, GD0)。將孕鼠隨機(jī)分為對照組和PNE組，每組8只。自GD11開始，PNE組給予尼古丁2 mg/(kg·d)(皮下注射，分2次給予)至分娩；對照組給予等體積蒸餾水。分娩0天，每窩仔鼠數(shù)量調(diào)整為8只(雌雄數(shù)量均等)，以保證哺乳期均等的營養(yǎng)。仔鼠于產(chǎn)后(postnatal week)1周PW1起每周稱體重，并計(jì)算PW1—36的體重增長率，體重增長率(%)=(PWX體重-PW1體重)×100/PW1體重。PW4斷奶后，各組每窩仔鼠隨機(jī)選1只雌鼠，給予高脂飲食[13]，PW24轉(zhuǎn)為標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)至PW40。兩組子代鼠于PW38—40給予不可預(yù)見性慢性應(yīng)激(unpredictable chronic stress, UCS)，末次應(yīng)激3天后，處死大鼠取血和海馬組織。從妊娠0天到出生后40周動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程圖見圖1。

圖1 從妊娠0天至生后40周動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程圖

2.不可預(yù)見性慢性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)(UCS)：根據(jù)文獻(xiàn)[14]，包括7種應(yīng)激因子，如攝食限制24 h、水限制24 h、尾部夾痛5 min、45 ℃烘箱烤5 min、4～8 ℃冷水游泳4 min、顛倒晝夜循環(huán)及社會(huì)隔離(每個(gè)籠子1只大鼠)24 h，共持續(xù)14 d。

3.血代謝表型測定：根據(jù)試劑盒的說明，檢測血ACTH、CORT、血糖、胰島素、TG、TCH、LDL-C和HDL-C的水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index, IRI)和TG、TCH、LDL-C與HDL-C的比值。

IRI=空腹血糖(FBG)×空腹胰島素(FINS)/22.5

4.海馬相關(guān)基因的表達(dá)：取海馬組織30 mg，按RNA-Solv Reagent 說明書提取總RNA。測A260和A280，并計(jì)算總RNA的濃度及純度，調(diào)整總RNA濃度至1 g/L。cDNA合成和PCR擴(kuò)增均按試劑盒方法說明進(jìn)行。檢測海馬組織11β-HSD1、GR和MR的mRNA表達(dá)。各引物見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物回收按試劑盒說明進(jìn)行。將回收產(chǎn)物以10倍梯度稀釋成一系列濃度，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取6個(gè)梯度濃度為標(biāo)準(zhǔn)品，與樣品一起采用實(shí)時(shí)定量PCR儀擴(kuò)增；以標(biāo)準(zhǔn)品的相對濃度為橫坐標(biāo)，測得各自的Ct值為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)的相對水平。

表1 引物序列

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示，采用雙尾t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、出生后體重及其增長率的變化

觀察和記錄PNE子代出生后1周體重及其變化情況，見圖2。PW1時(shí)，PNE組雌鼠體重為(10.3±0.5)g明顯低于對照組[(13.9±0.3)g]，直至PW40，PNE組雌鼠體重[(242.2±1.8)g]始終未超過對照組[(252.7±2.2)g]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析可見，在PW16前，PNE組雌鼠體重增長率(1540.62±65.58)超過對照組(1634.71±119.51)，之后持續(xù)高水平，出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示低出生體重的PNE組雌鼠在“高營養(yǎng)”狀態(tài)下體重呈現(xiàn)“追趕式生長”。

圖2 孕期尼古丁暴露對子代雌鼠體重和體重增長率的影響 A.生后1周和36周體重; B.每月體重; C.體重增長率。與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01；與生后一周比較，##P<0.01

二、HPA軸活性

通過檢測成年雌鼠血ACTH和CORT水平，海馬相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步了解成年雌鼠HPA軸的活性，見圖3。PNE組大鼠血ACTH水平[(16.36±2.58)pg/ml]與對照組相當(dāng)[(18.21±3.87)pg/ml]，血CORT水平[1061.76±92.58]較對照組[(361.06±97.47)pg/ml]明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A、B)；海馬11β-HSD1[0.12±0.03]明顯較對照組[0.05±0.01]升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而GR、MR表達(dá)及MR/GR[(6.85±1.01)、(0.16±0.05)、(0.03±0.01)]比與對照組相當(dāng)[(5.88±0.58)、(0.20±0.04)、(0.03±0.01)](圖3C—E)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示PNE組雌鼠經(jīng)歷體重追趕式生長和晚期慢性應(yīng)激后，海馬HPA軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)功能明顯減弱，HPA軸功能持續(xù)亢進(jìn)。

圖3 孕期尼古丁暴露對子代成年雌鼠血促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)酮水平及海馬相關(guān)基因表達(dá)的影響 A.血ACTH;B.血CORT;C.海馬11β-HSD1 mRNA;D.海馬GR mRNA;E.海馬MR mRNA;F.海馬 MR/GR。與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01

三、糖脂代謝功能

為觀察經(jīng)歷早期高營養(yǎng)和后期慢性應(yīng)激下PNE成年雌鼠糖脂代謝的改變，檢測和分析糖脂代謝血表型變化，見圖4。PNE組成年雌鼠的血糖和胰島素水平[(5.82±0.31)mmol/l、(103.39±9.11)μIU/ml]較對照組[(4.16±0.32)mmol/l、(45.14±1.39)μIU/ml]明顯升高，致使IRI[(27.86±5.15)]隨之較對照組[(8.11±1.29)]升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A—C)；PNE組成年雌鼠TG、TCH和LDL-C水平[(3.71±0.30)mmol/l、(1.35±0.14)mmol/l、(1.11±0.01)mmol/l]較對照組[(3.30±0.25)mmol/l、(1.23±0.10)mmol/l、(0.38±0.04)mmol/l]呈不同程度升高，尤以血LDL-C水平升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4D)；進(jìn)一步分析血脂比值改變發(fā)現(xiàn)，LDL-C/HDL-C比值(1.58±0.21)明顯高于對照組(0.66±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4E)。提示PNE成年雌鼠10月齡時(shí)出現(xiàn)高血糖、高胰島素血癥、IR及以LDL-C升高為主的高血脂。

圖4 孕期尼古丁暴露對子代成年雌鼠糖脂代謝的影響 A.血糖;B.血胰島素;C.胰島素抵抗指數(shù) (IRI);D.血脂;E.血脂比值。與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01

討 論

中國成人MS患病率達(dá)14%～16%[15]。MS是高血壓、高血糖、血脂紊亂和肥胖等多種疾病在人體內(nèi)集結(jié)的一種狀態(tài)，可直接引起脂肪肝、糖尿病和心腦血管疾病等。IR是共同的病理生理基礎(chǔ)。越來越多的證據(jù)表明，胎兒發(fā)育對宮內(nèi)環(huán)境的改變非常敏感，胎兒針對不良宮內(nèi)環(huán)境做出的適應(yīng)性反應(yīng)將對胎兒出生后的健康和生存產(chǎn)生長期的影響。流行病學(xué)調(diào)查表明，IUGR胎兒發(fā)生成年MS的概率是2.3%，是正常體重胎兒的5.75倍，提示MS存在宮內(nèi)起源[16]。追趕式生長可發(fā)生在包括嬰幼兒、青少年期和成年期在內(nèi)的生命任何階段，其目的是為了減輕或消除發(fā)育不良帶來的不利影響。然而，越來越多的研究顯示，這一代償機(jī)制會(huì)對機(jī)體造成后續(xù)危害，導(dǎo)致中心性肥胖、2型糖尿病和心血管疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)歷了出生后早期高營養(yǎng)狀態(tài)和成年期慢性應(yīng)激的10月齡PNE雌鼠出現(xiàn)高血皮質(zhì)酮、高血糖、高血胰島素、血脂紊亂，提示PNE可導(dǎo)致子代追趕式生長、IR及MS易感，患心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。

越來越多的研究提示，宮內(nèi)HPA軸的編程改變是成年后MS發(fā)生的最可能機(jī)制[17]，HPA軸的調(diào)控異常及GC的外周代謝參與了IR的發(fā)生、發(fā)展[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，海馬組織中11β-HSD1和GR共存于同一個(gè)神經(jīng)元內(nèi)[21]，11β-HSD1、GR與MR共同參與對HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)活動(dòng)。相關(guān)研究結(jié)果顯示，成年期4月齡IUGR仔鼠慢性應(yīng)激后海馬11β-HSD1、GR、MR等表達(dá)顯著升高，提示慢性應(yīng)激后IUGR仔鼠試圖通過產(chǎn)生更多的11β-HSD1和GR來負(fù)反饋抑制HPA軸活性，使亢進(jìn)的HPA軸逐漸回到基礎(chǔ)狀態(tài)[9-10]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)歷了生后早期高營養(yǎng)狀態(tài)和成年期慢性應(yīng)激的10月齡PNE組雌鼠的海馬11β-HSD1表達(dá)仍明顯高于對照組，但是GR的表達(dá)不再明顯增加、MR表達(dá)則呈降低趨勢，提示PNE組成年雌鼠海馬對HPA軸的負(fù)反饋抑制作用減弱，導(dǎo)致HPA軸功能呈持續(xù)亢進(jìn)狀態(tài)。過量的皮質(zhì)酮是可引起海馬神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致海馬損傷進(jìn)一步加劇，最終海馬HPA軸的負(fù)反饋機(jī)制逐漸減弱乃至消失，HPA軸功能出現(xiàn)紊亂。高水平的GC既是應(yīng)激性海馬損傷的結(jié)果，又是海馬進(jìn)一步損傷的原因。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，反映HPA軸活性的指標(biāo)——血ACTH和皮質(zhì)酮水平變化不一致，皮質(zhì)酮升高而ACTH不變，提示PNE成年雌鼠HPA軸的功能確實(shí)是紊亂的。

Reynolds[22]認(rèn)為，宮內(nèi)循環(huán)中高GC與宮內(nèi)糖脂代謝的編程關(guān)系密切。前期研究也證實(shí)[9,23]，PNE的IUGR子代出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌代謝編程改變與宮內(nèi)母源性GC過暴露有關(guān)，發(fā)現(xiàn)出生后4月齡子代仔鼠血糖不變但血脂升高，然而慢性應(yīng)激可增加血糖而降低血脂，即重現(xiàn)宮內(nèi)高GC下的糖脂代謝表型變化。隨后的系列研究進(jìn)一步證實(shí)，IUGR仔鼠在成年期呈現(xiàn)更為明顯的糖代謝功能減弱和血脂異常[24]。為了進(jìn)一步了解IUGR子代生活后期的糖脂代謝功能變化，本研究繼續(xù)觀察了經(jīng)歷出生后早期高營養(yǎng)狀態(tài)和成年期慢性應(yīng)激的10月齡仔鼠的糖脂代謝血表型變化。本研究發(fā)現(xiàn)，PNE組HPA軸功能持續(xù)亢進(jìn)的同時(shí)，呈現(xiàn)顯性高血糖、高胰島素血癥，并出現(xiàn)IR。同時(shí)血脂也是異常的，主要表現(xiàn)為高LDL-C血癥、LDL-C/HDL-C比值增加。PNE成年雌鼠的這種高血糖、高胰島素血癥和血脂紊亂的出現(xiàn)，高度提示MS易感。其發(fā)生可能與“HPA軸相關(guān)的宮內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌代謝編程”出現(xiàn)紊亂有關(guān)。糖脂代謝紊亂是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。高LDL-C和低HDL-C是缺血發(fā)作患者主要的危險(xiǎn)因子[25]。大量研究表明，血脂比值對冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的早期預(yù)防和診斷有較大的臨床價(jià)值，采用TCH/HDL-C、LDL-C/HDL-C比值能反映冠狀動(dòng)脈病變的范圍和程度，且對冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度的預(yù)測價(jià)值要優(yōu)于Lpa和apoB/apoA[26-28]。本研究分析了各血脂比值的改變，發(fā)現(xiàn)PNE組成年雌鼠具有更高的LDL-C/HDL-C比值，提示PNE組成年雌鼠心腦血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。

綜上所述，經(jīng)歷出生后早期高營養(yǎng)狀態(tài)和成年期慢性應(yīng)激生活事件的PNE10月齡仔鼠呈現(xiàn)高血糖、高胰島素血癥，出現(xiàn)IR；血脂紊亂，血脂比值升高，MS易感，患心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，其發(fā)生機(jī)制與HPA軸的宮內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌代謝編程出現(xiàn)紊亂相關(guān)，HPA軸的發(fā)育異常加快了MS及代謝性疾病的進(jìn)程。本研究進(jìn)一步解析了IUGR個(gè)體MS易感的宮內(nèi)起源機(jī)制，為這一特殊群體的宮內(nèi)預(yù)防和生后終生合理干預(yù)提供更多的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對倡導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育和提高IUGR特殊群體的生存質(zhì)量具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

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