毛連根 劉昌銘 楊 粟 江婷婷 陳鐘梁 屠慧惠 陳 靜 胡玉婷 甘 霖 李仲杰 李繼承，

(1 浙江大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究所，杭州，310058； 2 華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州，510006)

知柏地黃丸對(duì)陰虛“上火”證血清抗炎凝血蛋白的影響

毛連根1劉昌銘1楊 粟1江婷婷2陳鐘梁1屠慧惠1陳 靜1胡玉婷2甘 霖2李仲杰1李繼承1，2

(1 浙江大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究所，杭州，310058； 2 華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州，510006)

目的：探究知柏地黃丸(Zhibai Dihuang Granule；ZDG)對(duì)陰虛“上火”證血清抗炎凝血蛋白的影響。方法：通過(guò)腹腔注射三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine；T3)處理SD大鼠建立陰虛模型。在該模型基礎(chǔ)上往大鼠牙齦出滴加牙齦卟啉單胞菌疊加口腔牙齦炎模型，建立陰虛“上火”證大鼠模型。用滋陰降火藥知柏地黃丸對(duì)大鼠進(jìn)行治療，以iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白組學(xué)技術(shù)與生物信息學(xué)手段分析治療前后陰虛“上火”大鼠血清差異性蛋白表達(dá)譜，探索知柏地黃丸治療陰虛“上火”的生物學(xué)機(jī)制。結(jié)果：知柏地黃丸觀察組大鼠血清凝溶膠蛋白(Gsn)、纖溶酶原(Plg)、纖維蛋白原α鏈(Fga)、胸腺素β4(Tmsb4x)比值顯著上調(diào)(Fold Change>1.25)；膠原蛋白α2-I型鏈(Col1a2)比值顯著下調(diào)(Fold Change<0.8)。Gsn是機(jī)動(dòng)蛋白絲的切割蛋白，參與細(xì)胞凋亡、清除損傷組織、調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)等生物學(xué)功能；Plg是血液纖維蛋白水解酶無(wú)活性的前體，參與機(jī)體纖溶、細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)降解等多種生物過(guò)程；Fga是由肝臟合成的纖維蛋白前體，能在內(nèi)源凝血因子或外源組織因子作用下生成纖維蛋白，參與機(jī)體的凝血過(guò)程；Colla2是由肝、巨核細(xì)胞合成的凝血蛋白酶，是活化Fga的凝血穩(wěn)定因子，F(xiàn)ga在Colla2的作用下參與完成凝血過(guò)程；T-β4是由胸腺產(chǎn)生的淋巴生長(zhǎng)因子，具有通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞的遷移、增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞功能、抑制炎性因子、促進(jìn)組織重塑、血管生成和傷口愈合修復(fù)等生物學(xué)功能。結(jié)論：知柏地黃丸通過(guò)對(duì)Gsn、Plg、Fga、Colla2、T-β4水平的調(diào)節(jié)，清除損傷組織，釋放肌動(dòng)蛋白、細(xì)菌脂多糖，抑制細(xì)胞凋亡作用；并且可以調(diào)節(jié)炎性因子，改變炎性反應(yīng)部位血液流變動(dòng)力學(xué)障礙，促進(jìn)炎性反應(yīng)損傷的愈合的作用。

知柏地黃丸；陰虛“上火”；蛋白組學(xué)；抗炎；凝血；發(fā)病機(jī)制

中醫(yī)認(rèn)為情志是機(jī)體的精神狀態(tài)，是人對(duì)客觀外界事物和現(xiàn)象所做出的7種不同情緒反映[1]。情志與臟腑的功能活動(dòng)密切相關(guān)，情志過(guò)激可致相火妄動(dòng)，相火妄動(dòng)是導(dǎo)致疾病的因素之一[2-3]。以腹腔注射三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine；T3)處理SD大鼠建立陰虛模型[4]，并在模型基礎(chǔ)上疊加口腔牙齦炎模型，建立陰虛“上火”證(Yin-deficiency-Shanghuo Syndrome，YDS)大鼠模型；以iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白組篩選鑒定技術(shù)與生物學(xué)信息手段探究知柏地黃丸對(duì)YDS大鼠血清抗炎凝血生物物質(zhì)的變化，為探究闡明知柏地黃丸滋陰降火治療機(jī)制與陰虛“上火”證病機(jī)提供現(xiàn)代生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取SPF級(jí)雌性SD大鼠30只(浙江省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可批準(zhǔn)文號(hào)：SCXK(浙)2014-0001)。

1.1.2 藥物 三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine；T3，北京百靈威科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：L840O63)；牙髓卟啉單胞菌冷凍干菌粉(廣東省微生物菌種保藏中心，生產(chǎn)批號(hào)：201505)；戊巴比妥鈉(中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司(進(jìn)口分裝)，生產(chǎn)批號(hào)：020402)；知柏地黃丸(ZhibaiDihuangGranule；ZDG，仲景宛西制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：161204)。

1.1.3 試劑與儀器 iTRAQ試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster city，CA,USA)；LCMS-8030、Triple Quadrupole MS/MS(日本島津制作所)；超低溫冰箱THERMO(902-ULTS)；離心機(jī)(SIGMA,2K15C)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 取5～6周齡，體重220～240 g SPF級(jí)雌性SD大鼠30只。稱重，隨機(jī)分成YDH模型組(簡(jiǎn)稱：模型組)、生理鹽水對(duì)照組(簡(jiǎn)稱：對(duì)照組)、知柏地黃丸觀察組(簡(jiǎn)稱：觀察組)3組，每組10只。第2天開(kāi)始，模型組、觀察組每天下午4點(diǎn)腹腔注射T3(2.5 mg%，0.2 mL/100(g·d))、對(duì)照組腹腔注射0.9%生理鹽水(0.2 mL/100(g·d))，連續(xù)造模6 d。此間，模型組、觀察組大鼠，于腹腔注射T3第4天以2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉，用絲線結(jié)扎下門(mén)齒，剝離部分牙齦，滴注PBS(pH7.2)稀釋至近似3×108/mL的牙髓卟啉單胞菌液，200 μL/(次·d)，共4次進(jìn)行牙齦炎造模。對(duì)照組大鼠不進(jìn)行牙齦炎造模。第7天起，觀察組灌胃知柏地黃丸中藥(0.8 g/1 mL，1 mL/100(g·d)、模型組與對(duì)照組灌胃(0.9%生理鹽水，1 mL/100(g·d)。連續(xù)給藥治療7 d。給藥治療第8天，觀察組于給藥后2 h(對(duì)照組、模型組于給生理鹽水后2 h)以2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉，進(jìn)行頸中動(dòng)脈插管手術(shù)取血采樣。將血分別置于無(wú)肝素試管，室溫靜置2 h，3 000 r/min，離心10 min，提取血清，置-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 iTRAQ-2DLC-MS/MS血清差異蛋白篩選鑒定分析 血清高豐度蛋白去除：用4.6×100 mm多親和處理系統(tǒng)(MARS)LC Column-Human 14結(jié)合HPLC系統(tǒng)處理血清樣品，除去14種高豐度蛋白(血清白蛋白、免疫球蛋白G，抗胰蛋白酶，IgA，IgM等)。iTRAQ試劑標(biāo)記：每組取等量血清樣本，先用預(yù)冷的丙酮處理，12 000 r/min離心15 min后棄去上清后，用試劑盒中自帶的溶解液和1% SDS充分混懸溶解樣品；還原試劑于60 ℃反應(yīng)1 h；半胱氨酸封閉試劑于室溫處理10 min；胰蛋白酶于37 ℃酶解過(guò)夜，使蛋白質(zhì)酶解。在118、119、121各管標(biāo)記試劑中加入50 μL異丙醇，混勻，分別加入各組樣品中于室溫反應(yīng)1 h，各加入3倍體積水，使標(biāo)記試劑分解。最后合并各管標(biāo)記好的樣品，真空冷凍干燥處理。第一維SCX分離肽段：將iTRAQ試劑標(biāo)記的樣品混合物加入強(qiáng)陽(yáng)離子交換(SCX)柱中多次洗脫。根據(jù)峰型和時(shí)間共收取10個(gè)梯度，真空離心濃縮后，用反相液相色譜的A相溶解。第二維反相液相色譜：用ZORBAX 300SB-C18column處理，用不同濃度的乙腈和甲酸的洗脫液洗脫。LC-MS/MS分析：將2DLC分離獲得的蛋白質(zhì)直接進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜掃描分析。在QSTAR XL在IDA模式下操作，在m/z 400-1 500范圍內(nèi)進(jìn)行MS分析，在一個(gè)圖譜選擇20個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行串級(jí)掃描，掃描范圍m/z 100-2 000。獲得差異蛋白表達(dá)譜。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 采用Protein Pilot 4.2 beta軟件分析數(shù)據(jù)，檢索International Protein Index(IPI)數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)其定量。使用DAV ID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)方法對(duì)蛋白質(zhì)注釋和分類(lèi)。蛋白之間的互作關(guān)系應(yīng)用STRING軟件完成(http://string.embl.de/)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)分析，非參數(shù)分析用Mann-Whitney U-test檢測(cè)，組間差異比較采用單因素方差分析。差異蛋白比倍率>1.25或<0.8認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 知柏地黃丸治療陰虛大鼠“上火”血清差異性蛋白篩選鑒定分析結(jié)果 觀察組血清凝溶膠蛋白(Gsn)、纖溶酶原(Plg)、纖維蛋白原α鏈(Fga)、胸腺素β4(Tmsb4x)比值顯著上調(diào)(Fold change>1.25)；膠原蛋白α2-I型鏈(Col1a2)比值顯著下調(diào)(Fold change<0.8)。見(jiàn)表1。

注：差異蛋白比倍率>1.25或<0.8認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討論

陰虛“上火”是現(xiàn)代社會(huì)多發(fā)頻發(fā)病證，誘因復(fù)雜?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)陰虛“上火”缺乏有效的治療方法，但中醫(yī)對(duì)陰虛“上火”的認(rèn)識(shí)已歷史悠久，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)》[5]，《景岳全書(shū)》[6]等許多中醫(yī)經(jīng)典對(duì)“上火”證病機(jī)與治療早有詳細(xì)記載。陰虛“上火”系人體陰陽(yáng)失衡內(nèi)熱亢盛，“相火妄動(dòng)”所致，對(duì)于該證以滋陰降火為治療原則。陰虛“上火”證主要表證為反復(fù)發(fā)作的口腔潰瘍、牙齦腫痛炎、鼻扭、慢性咽喉炎等與皮膚黏膜關(guān)聯(lián)密切的炎性反應(yīng)，而炎性反應(yīng)是機(jī)體血管生物物質(zhì)對(duì)于機(jī)體損傷的防御反應(yīng)，炎性反應(yīng)發(fā)生進(jìn)程中的血管中的抗炎與凝血生物物質(zhì)對(duì)于防御反應(yīng)具有重要作用。以知柏地黃丸為工具探究陰虛“上火”證血管中的抗炎與凝血生物物質(zhì)的變化，對(duì)于闡明知柏地黃丸滋陰降火作用機(jī)制及陰虛“上火”證病機(jī)具有重要意義。

研究結(jié)果顯示，知柏地黃丸具有上調(diào)血清Gsn、Plg、Fga表達(dá)的作用。Plg是機(jī)動(dòng)蛋白絲的切割蛋白，在CaCl2、pH、磷酸磷脂酰肌醇等作用下，能參與對(duì)肌動(dòng)蛋白絲的剪切、聚合和解聚；也可以作為細(xì)胞凋亡過(guò)程中關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一胱天蛋白酶的底物與二磷酸磷脂酰肌醇-3形成的復(fù)合體，降低二磷酸磷脂酰肌醇-3活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程[7]；Gsn還能與脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合脂多糖，抑制與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合活性和血清肌動(dòng)蛋白的解聚活性；Gsn能在清除損傷組織細(xì)胞釋放的肌動(dòng)蛋白同時(shí)，對(duì)炎性反應(yīng)遞質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)[8-9]。血液中Gsn過(guò)表達(dá)有利于減輕炎性反應(yīng)與炎性反應(yīng)損傷的愈合[10]。知柏地黃丸對(duì)Gsn的上調(diào)作用提示知柏地黃丸具有清除損傷組織細(xì)胞釋放的肌動(dòng)蛋白、降解脂多糖，減輕炎性反應(yīng)促進(jìn)炎性反應(yīng)損傷愈合和抑制細(xì)胞凋亡的作用。

研究結(jié)果顯示，知柏地黃丸組還具有上調(diào)Plg、Fga下調(diào)Colla2的作用。Plg是血液纖維蛋白水解酶無(wú)活性的前體，其能在內(nèi)源性纖溶酶原激活物或外源激活物的作用下活化成纖溶酶，參與機(jī)體纖溶、細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)降解等多種生物過(guò)程。知柏地黃丸上調(diào)Plg表達(dá)，提示知柏地黃丸具有提高纖溶酶生成基質(zhì)，促進(jìn)纖溶酶生成量進(jìn)而改變炎性反應(yīng)損傷組織部位血液流變動(dòng)力學(xué)障礙，促進(jìn)炎性反應(yīng)傷口愈合作用。Fga是由肝臟合成的纖維蛋白前體，能在內(nèi)源凝血因子或外源組織因子作用下生成纖維蛋白，參與機(jī)體的凝血過(guò)程。Colla2是由肝、巨核細(xì)胞合成的凝血蛋白酶，是活化Fga的凝血穩(wěn)定因子，F(xiàn)ga在Colla2的作用下參與完成凝血過(guò)程。知柏地黃丸上調(diào)血清Fga表達(dá)，但對(duì)Colla2顯著下調(diào)，這樣仍然影響凝血形成過(guò)程。這提示知柏地黃丸具有抗凝血形成的促進(jìn)血液循環(huán)作用。

研究結(jié)果還顯示，知柏地黃丸具有上調(diào)T-β4表達(dá)作用。T-β4是由胸腺產(chǎn)生的淋巴生長(zhǎng)因子，其具有通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞的遷移，增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞功能，抑制炎性因子，降低炎性反應(yīng)細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕炎性反應(yīng)與防止新生組織受到炎性反應(yīng)的損害的作用[11]；T-β4還具有促進(jìn)組織重塑、血管生成和傷口愈合修復(fù)等功能[12]。知柏地黃丸上調(diào)T-β4表達(dá)的作用，這表明知柏地黃丸具抑制炎性因子，增強(qiáng)抗炎與炎性反應(yīng)傷口愈合修復(fù)能力的作用。

上述結(jié)果提示：知柏地黃丸通過(guò)對(duì)Gsn、Plg、Fga、Colla2、T-β4蛋白組的調(diào)節(jié)改變陰虛“上火”證炎性反應(yīng)損傷組織部位的血液流變動(dòng)力學(xué)障礙，促進(jìn)血液循環(huán)及抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)抗炎與炎性反應(yīng)傷口愈合修復(fù)能力。這結(jié)果也提示陰虛“上火”證炎性反應(yīng)反復(fù)發(fā)作與這些蛋白的調(diào)節(jié)改變密切關(guān)聯(lián)。

[1]孫廣仁.中醫(yī)基礎(chǔ)理論[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2002:225.

[2]包潔,周傳龍,謝志軍,等.從情志理論探析中醫(yī)“上火”[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,16(4):8-15.

[3]朱震享.丹溪心法[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2017:6.

[4]付曉伶,方肇勤.陰虛證動(dòng)物模型的造模方法及評(píng)析[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2004,18(2):51-54.

[5]金·劉完素.素問(wèn)玄機(jī)原病式[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1983.

[6]漢·張仲景.傷寒論[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005.

[7]Philchenkov AA.Caspases as regulators of apoptosis and other cell functions[J].Biochemistry Biokhimiia，2003,68(4)：365-376.

[8]Bucki R,Georges PC,Espinassous Q,et al.Inactivation of endotoxin by human plasma gelsolin[J].Biochemistry,2005,44(28):9590-9597.

[9]DiNubile MJ.Plasma gelsolin as a biomarker of inflammation[J].Arthritis Research & Therapy，2008,10(6)：124.

[10]王藝萍,肖菲.查爾森合并癥指數(shù)聯(lián)合血漿凝溶膠蛋白水平預(yù)測(cè)膿毒癥患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué),2014,34(12):1057-1060.

[11]Sosne G，Chan CC，Thai K，et al.Thymosin beta 4 promotes corneal wound healing and modulates inflammatory mediators in vivo[J].Experimental Eye Research,2001,72(5)：605-608.

[12]Qiu P,Kurpakus-Wheater M,Sosne G.Matrix metalloproteinase activity is necessary for thymosin beta 4 promotion of epithelial cell migration[J].J Cell Physiol,2007,212(1):165-173.

EffectofZhibaiDihuangGranuleonAnti-inflammatoryandClottingSerumProteinsinYin-deficiencyShanghuoSyndrome

Mao Liangen1, Liu Changming1, Yang Su1, Jiang Tingting2, Chen Zhongliang1, Tu Huihui1, Chen Jing1, Hu Yuting2, Gan Lin2, Li Zhongjie1, Li Jicheng1, 2

(1InstituteofCellBiology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China; 2SchoolofMedicine,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)

Objective:To explore the influence of Zhibai Dihuang Granule (ZDG) on the anti-inflammatory clotting serum proteins in Yin-deficiency Shanghuo(YDS) syndrome. Yin-deficiency SD rats were induced by intraperitoneal injection of Triiodothyronine (T3). The models of gingivitis in rats were induced by dropwise add of porphyromonas gingivalis model. YDS syndrome rats were treated with ZDG for 1 week. iTRAQ-2DLC-MS/MS was used in screening and identifying the serum differential proteins. With the treatment of ZDG, the serum level of Gelsolin (Gsn), Plasminogen (Plg), Fibnnogenalpha chain (Fga), and Thymus beta-4 (T-β4) were significantly increased (fold change>1.25), while the serum level of Collagulation factor XIII Achain and Colla2 were significantly decreased (fold change<0.8). Gsn possesses the function of removing damaged tissue, releasing the actin, inhibiting the apoptosis of the cells, and inhibiting the apoptosis of the cells. Colla2 and Plgcan regulated the change of blood rheology in the inflammatory site. Gsn and T-beta 4 presented the ability in regulating inflammatory cytokines to promote the healing of inflammatory damage.ConclusionZDG may play an important role in clearing actin and lipopolysaccharide released by damage tissue and inhibiting the cell apoptosis. Besides, ZDG may regulate inflammatory factors, change the blood rheology of the inflammatory site, promot the healing of inflammatory damage. In short, ZDG treats YDH syndrome by regulating these proteins associated with anti-inflammatory and clotting.

Zhibai Dihuang Granule; Yin-deficiency Shanghuo syndrome; Proteomics; Anti-inflammatory; Clotting; Pathogenesis

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.006

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2014CB543002)

毛連根(1957.06—)，男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：藥理學(xué)，E-mail：zdmlg301@126.com

李繼承(1957.12—)，男，碩士，教授，浙江大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究所所長(zhǎng)，研究方向：肺結(jié)核生物學(xué)標(biāo)志物及其中醫(yī)證候的生物學(xué)研究，E-mail：lijichen@zju.edu.cn

(2017-11-03收稿 責(zé)任編輯：張文婷)