周蕾 姜妮 王小利 周心娜 司文 任軍

中晚期胃癌患者外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)的臨床意義

周蕾 姜妮 王小利 周心娜 司文 任軍

目的：研究胃癌患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化的臨床意義。方法：選取2015年10月至2016年5月北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治的67例胃癌患者，抽取外周血，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞及其亞群，同時(shí)抽取外周血檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物CEA、CA199，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析比較，并對(duì)患者進(jìn)行隨訪。結(jié)果：67例胃癌患者中，Ⅲ期患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.3±5.1，Ⅳ期患者Tc（CD8+ CD28+）均值為9.9±4.6，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.043）；CEA升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為9.3±3.6，而CA199未升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.1±5.6（P=0.025）。CA199升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為9.3±4.2，而CEA未升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.1±5.3（P=0.029），Tc（CD8+CD28+）下降的患者較未下降的患者的總生存時(shí)間（overall survival，OS）降低（8.1個(gè)月vs.15.1個(gè)月，P=0.008）。結(jié)論：胃癌患者隨著TNM分期的提高，其機(jī)體的細(xì)胞免疫功能呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)；CEA、CA199升高的患者Tc（CD8+CD28+）降低，二者呈負(fù)相關(guān)；Tc（CD8+CD28+）降低，患者的OS縮短。

胃癌 淋巴細(xì)胞亞群 免疫功能

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)密切相關(guān)，腫瘤患者通常伴有免疫抑制或損害，如果免疫功能持續(xù)下降，可促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，降低患者的生存質(zhì)量和生存率［1-2］。外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)是反應(yīng)腫瘤患者免疫狀態(tài)的常用方法，但是其在臨床中的作用以及與預(yù)后的關(guān)系尚未完全明確。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析了67例晚期胃癌患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群不同淋巴細(xì)胞的含量，探討其與胃癌常用腫瘤標(biāo)記物CEA、CA199的關(guān)系，以及與患者總生存時(shí)間（overall survival，OS）的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 選取2015年10月至2016年5月北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治的67例胃癌患者，均經(jīng)病理活檢確診，影像學(xué)證實(shí)臨床分期為晚期，無(wú)手術(shù)適應(yīng)證。年齡27～89歲，平均年齡（62.0±13.6）歲；臨床分期：Ⅲ～Ⅳ期，Ⅲ期32例、Ⅳ期35例；男性47例、女性20例；腫瘤位置：賁門(mén)19例、胃體24例、胃底8例、胃竇14例；分化程度：高分化4例、中分化13例、中低分化8例、低分化35例、未明確7例；轉(zhuǎn)移情況：肝轉(zhuǎn)移18例、肺轉(zhuǎn)移4例、骨轉(zhuǎn)移38例、腦轉(zhuǎn)移1例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。此項(xiàng)臨床研究經(jīng)北京世紀(jì)壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 試劑及儀器 流式細(xì)胞儀FC500及其配套的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Beckman-Coulter公司；雅培i-4000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀購(gòu)自美國(guó)雅培公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè) 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)抽取外周靜脈血4 mL放入EDTA抗凝管，使用直接免疫熒光標(biāo)記全血溶血法，流式細(xì)胞儀測(cè)定被檢者外周血淋巴細(xì)胞及其亞群。A～F共6管中分別加標(biāo)有熒光的抗體10 μL、血液樣本50 μL，振蕩。室溫避光放置15 min后加溶血素（BD）400 μL，室溫避光放置8 min后加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液（PBS），室溫1 500 r/min離心5 min，棄液、留底部細(xì)胞加入PBS液400 μL，震蕩后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 外周血CEA、CA199的檢測(cè) CEA、CA199檢測(cè)同時(shí)抽取外周靜脈血4 mL入惰性分離膠促凝管（內(nèi)含分離膠和促凝劑），化學(xué)發(fā)光免疫分析法（che?miluminesent immunoassay，CLIA）進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，應(yīng)用Kaplan-Meier法和Log rank檢驗(yàn)進(jìn)行OS的分析，并繪制生存曲線。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床分期的胃癌患者T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

Ⅲ期患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.3±5.1，Ⅳ期患者Tc（CD8+CD28+）均值為9.9±4.6，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.043），而Tr（CD4+CD25+）、Ts（CD8+CD28-）、NK、NKT等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 Ⅲ期和Ⅳ期胃癌患者T淋巴細(xì)胞亞群分布Table 1 Lymphocyte subset distribution of stages III and IV gastric cancer patients

2.2 T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果與腫瘤標(biāo)記物的相關(guān)性。

CEA升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為9.3± 3.6，而CEA未升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.1±5.6（P=0.025）；CA199升高的患者Tc（CD8+ CD28+）均值為9.3±4.2，而CEA未升高的患者Tc（CD8+CD28+）均值為12.1±5.3（P=0.029），見(jiàn)表2。

2.3 T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果與患者OS的關(guān)系。

67例胃癌患者隨訪時(shí)間為18個(gè)月，無(wú)失訪患者，隨訪結(jié)果T細(xì)胞亞群中，Tc（CD8+CD28+）下降的患者較未下降患者的OS降低（8.1個(gè)月vs.15.1個(gè)月，P=0.008，圖1）。其它亞群的細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表2 胃癌患者T淋巴細(xì)胞亞群與腫瘤標(biāo)記物的關(guān)系Table 2 Correlation between lymphocyte subsets and tumor markers of gastric cancer patients

圖1 不同狀態(tài)的Tc（CD8+CD28+）胃癌患者的生存曲線Figure 1 Progression-free survival curve of gastric cancer patients with different average values of Tc(CD8+CD28+)

表3 胃癌患者不同淋巴細(xì)胞亞群與總生存時(shí)間的相關(guān)性Table 3 Overall survival in gastric cancer patients with different lymphocyte subsets

3 討論

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)功能最重要的細(xì)胞群，在正常機(jī)體內(nèi)各個(gè)T淋巴細(xì)胞亞群相互作用，維持著機(jī)體正常的免疫功能。T淋巴細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志分為不同功能亞群?？笴D3單抗與CD3抗原分子的ε鏈結(jié)合，是總T細(xì)胞的標(biāo)志，而CD4、CD8不能同時(shí)表達(dá)于成熟的T淋巴細(xì)胞表面，故可將成熟的T淋巴細(xì)胞分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞二個(gè)亞群。

惡性腫瘤患者通常出現(xiàn)免疫失衡，多表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能紊亂，主要表現(xiàn)為T(mén)淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生改變，具體表現(xiàn)為CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+/CD4+T淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞含量改變［3］。有研究結(jié)果顯示，胃癌患者外周血CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞的含量以及CD4+/ CD8+淋巴細(xì)胞比值明顯低于正常人，CD8+細(xì)胞則明顯高于正常人［4］，CD8＋T淋巴細(xì)胞與患者的預(yù)后相關(guān)［4-5］；CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞升高的乳腺癌患者更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移［6］，而化療、放療等臨床治療有可能改變患者T淋巴細(xì)胞亞群的狀態(tài)［7-8］。

隨著基礎(chǔ)研究的不斷進(jìn)展，本研究發(fā)現(xiàn)CD8+的T細(xì)胞依據(jù)CD28抗原的不同，又進(jìn)一步分為CD8+ CD28+和CD8+CD28-兩組不同的T淋巴細(xì)胞亞群，而這兩組不同的細(xì)胞亞群在細(xì)胞免疫過(guò)程中分別有著完全不同的功能。CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞被稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，Tc），是抗腫瘤免疫的主要?dú)?xì)胞；CD8+CD28-T淋巴細(xì)胞被稱為調(diào)節(jié)性的T細(xì)胞（suppressor T lymphocyte，Ts），參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的過(guò)程，這種調(diào)節(jié)的作用可能是正調(diào)節(jié)或是負(fù)調(diào)節(jié)。

目前的臨床研究大多只是檢測(cè)CD4+和CD8+的淋巴細(xì)胞的含量，對(duì)于患者免疫狀態(tài)的判斷有一定的局限性。本研究用流式分析法將CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞根據(jù)其不同的細(xì)胞表面抗原進(jìn)一步分為不同的亞群Tc（CD8+CD28+）和Ts（CD8+CD28-），并與腫瘤的臨床分期、腫瘤標(biāo)志物、預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行了分析。本研究將Ⅲ期與Ⅳ期胃癌患者的T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分析，CD4+與CD8+的T淋巴細(xì)胞兩組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；將CD8+的T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行亞群分析，CD8+CD28-T淋巴細(xì)胞亞群兩組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅CD8+CD28+兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明CD8+CD28+與其它的檢測(cè)指標(biāo)相比更能反映患者的免疫狀態(tài)；TNM分期不同的患者，Tc（CD8+CD28+）值不同，分期越晚Tc（CD8+ CD28+）越低。Tc（CD8+CD28+）具有識(shí)別抗原的特異性，能殺傷具有特定的外來(lái)抗原與自身主要組織相容性抗原I（major histocompatibility antigen I，MHcI）結(jié)合的復(fù)合物的靶細(xì)胞，是殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性淋巴細(xì)胞。隨著腫瘤分期的升高，Tc（CD8+CD28+）呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明晚期患者抗腫瘤能力即殺傷腫瘤的能力下降。調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的腫瘤治療目前已應(yīng)用于臨床，獲得較好的療效［9-12］。CEA、CA199是胃癌常用的腫瘤標(biāo)記物，與病情進(jìn)展有一定的關(guān)系，對(duì)臨床療效的評(píng)價(jià)也有一定的參考意義。CEA、CA199持續(xù)升高表明患者的腫瘤負(fù)荷增加，病情進(jìn)展，但是CEA、CA199與患者免疫功能變化的關(guān)系，特別是重要的抗腫瘤Tc的關(guān)系，尚缺乏報(bào)道。本研究結(jié)果表明CEA、CA199的數(shù)值與Tc（CD8+CD28+）的變化，兩者呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明隨著患者病情的加重，機(jī)體抗腫瘤免疫的功能也是下降的，Tc（CD8+CD28+）的變化也是病情變化的參考指標(biāo)之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)Tc（CD8+CD28+）對(duì)患者的總生存有重要的作用，Tc（CD8+CD28+）降低的患者OS縮短。CD4+/CD8+細(xì)胞比值是反映免疫狀態(tài)的主要指標(biāo)，CD4+/CD8+細(xì)胞比值下降預(yù)示機(jī)體免疫功能降低。本研究的結(jié)果表明CD4+/CD8+細(xì)胞比值下降組和未下降組在OS上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是兩組間比較有4.9個(gè)月的差值（6.0個(gè)月vs.10.9個(gè)月），其無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因可能是因?yàn)镃D4+和CD8+包含了其它功能的亞群細(xì)胞，因而Tc（CD8+CD28+）更直接地反映了機(jī)體免疫狀態(tài)，與預(yù)后的關(guān)系更明顯。Tr（CD4+ CD25+）又稱為調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（regulatory T lym?phocyte，Treg），目前研究發(fā)現(xiàn)Treg可以通過(guò)多種機(jī)制來(lái)抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能，是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素，并且其增高水平與病程進(jìn)展和臨床病理存在顯著相關(guān)性［12-13］，Treg升高的患者中OS為9.6個(gè)月，Treg降低的患者中OS為10.3個(gè)月，Treg升高則OS縮短。以Treg及相關(guān)免疫抑制性分子作為治療靶點(diǎn)，抑制Treg的功能來(lái)開(kāi)展腫瘤免疫治療可能成為今后腫瘤治療的發(fā)展方向。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Tc（CD8+CD28+）與胃癌患者的臨床分期與腫瘤標(biāo)記物升高相關(guān)，Tc（CD8+ CD28+）降低則OS縮短，預(yù)示患者不良的預(yù)后。隨著新的淋巴細(xì)胞亞群研究的不斷深入及其臨床意義不斷被發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)將成為腫瘤診療的重要參考依據(jù)。

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（2016-11-07收稿）

（2017-03-06修回）

（編輯：武斌 校對(duì)：楊紅欣）

Detection of lymphocyte immune function in peripheral blood of patients with advanced gastric cancer

Lei ZHOU,Ni JIANG,Xiaoli WANG,Xinna ZHOU,Wen SI,Jun REN

Jun REN;E-mail:jun.ren@duke.edu
Department of Medical Oncology,Capital Medical University Cancer Center,Beijing Shijitan Hospital,Beijing 100038,China

Objective:To investigate the clinical significance of the changes of T lymphocyte subsets in the peripheral blood of patients with gastric cancer.Methods:The lymphocyte subsets in 67 patients with gastric cancer were analyzed with flow cytometry.CEA and CA199 from all patients were also detected.Results were statistically analyzed,and the patients were followed up.Results:The average values of Tc(CD8+CD28+)in patients with stagesⅢandⅣgastric cancer were 12.3±5.1 and 9.9±4.6,respectively,with significant difference(P=0.043).The average values of Tc(CD8+CD28+)in patients with elevated CEA and with normal CEA were 9.3±3.6 and 12.1± 5.6,respectively(P=0.025).Similarly,the average values of Tc(CD8+CD28+)in patients with elevated CA199 and with normal CEA were 9.3±4.2 and 12.1±5.3,respectively(P=0.029).The overall survival of patients with decreased Tc(CD8+CD28+)was lower than that of patients with normal Tc(CD8+CD28+)(8.1vs.15.1 months,P=0.008).Conclusion:The cellular immune function of patients with gastric cancer gradually decreased with the progression of TNM.Higher CA199 and CEA values indicated lower average values of Tc(CD8+ CD28+).The overall survival of patients with decreased Tc(CD8+CD28+)was lower.

gastric cancer,lymphocyte subsets,immune function

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.05.281

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（北京市100038）

任軍 jun.ren@duke.edu

周蕾 專業(yè)方向?yàn)槟[瘤分子生物學(xué)及靶向治療。

E-mail：zhoulei-057@163.com