邵高能 謝黎虹 焦桂愛 魏祥進(jìn) 圣忠華 唐紹清胡培松

實(shí)驗(yàn)技術(shù)

利用CRISPR/CAS9技術(shù)編輯水稻香味基因Badh2

邵高能 謝黎虹 焦桂愛 魏祥進(jìn) 圣忠華 唐紹清*胡培松*

(中國(guó)水稻研究所/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部水稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；*通訊聯(lián)系人, E-mail： sqtang@126.com, hupeisong@caas.cn)

【目的】香稻作為一類特殊的水稻群體，以其清香可口的品質(zhì)特性備受消費(fèi)者的歡迎。到目前為止，水稻中的香味主要受第8染色體上編碼甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2控制?！痉椒ā客ㄟ^CRISPR/CAS9技術(shù)對(duì)中花11的香味基因Badh2進(jìn)行編輯。【結(jié)果】獲得轉(zhuǎn)基因T0代植株并對(duì)其所衍生的T1代20個(gè)單株進(jìn)行了鑒定分析，獲得了一個(gè)剔除了載體骨架且第1外顯子上插入一個(gè)堿基T 的突變體材料。該材料中Badh2 RNA水平顯著下調(diào)；利用GC-MS技術(shù)測(cè)定野生型及突變體材料籽粒2-乙酰-1-吡咯啉含量，結(jié)果表明突變體材料中的香味物質(zhì)顯著增加；此外，我們還對(duì)野生型及T2代香型植株水稻產(chǎn)量及稻米蒸煮食味品質(zhì)進(jìn)行了考查及測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)除分蘗數(shù)及結(jié)實(shí)率呈現(xiàn)出顯著差異外（P＜0.05），其余各項(xiàng)指標(biāo)在兩組材料間都無顯著差異?！窘Y(jié)論】通過CRISPR/CAS9技術(shù)成功地對(duì)水稻香味基因進(jìn)行了編輯，可為香稻育種提供豐富的理論指導(dǎo)，加快香稻的育種進(jìn)程。

水稻；Badh2；CRISPR/CAS9；香味

近些年來，大量研究報(bào)道了水稻香味基因的研究，主要包括香味基因的遺傳分析，基因的克隆以及香味基因的育種利用等[2-4]。早期研究表明香味基因主要由1～3對(duì)顯性或隱性基因控制[2,4]，隨著研究的深入，遺傳分析結(jié)果表明水稻中香味主要受位于第8染色體上的一個(gè)單隱形基因Badh2控制，該基因編碼甜菜堿脫氫酶[5]，包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，共編碼503個(gè)氨基酸，研究表明該基因與香味密切相關(guān)并成功克隆[5-6]。香味物質(zhì)的合成也是香稻研究的重要方面，前人報(bào)道了脯氨酸和鳥氨酸可能為香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的前體物質(zhì)[7]，當(dāng)Badh2突變后導(dǎo)致香味物質(zhì)2-AP含量的大量積累，非香稻材料中該基因所編碼的蛋白甜菜堿脫氫酶可能通過催化其底物4-氨基丁醛進(jìn)而轉(zhuǎn)化為4-氨基丁酸，而香稻材料中則可能促進(jìn)4-氨基丁酸轉(zhuǎn)化為1-吡咯啉，進(jìn)而與乙?；鶊F(tuán)結(jié)合，從而形成香味物質(zhì)2-AP，但具體的Badh2蛋白功能及2-AP代謝途徑還沒有徹底研究清楚[6]。

分子標(biāo)記輔助選擇被認(rèn)為是一種有效的育種手段，特別適合于一些性狀考查比較困難的基因。香味性狀的鑒定相對(duì)比較困難，容易受主觀因素的影響，因此，香味基因分子標(biāo)記輔助選擇可以大大提高其選擇的效率。Badh2第7外顯子8 bp缺失的突變體基因badh2首先被報(bào)道。此外，Chen等[5]還發(fā)現(xiàn)了Badh2另外一個(gè)等位基因，即第2外顯子存在7 bp的缺失，并將有功能的Badh2基因轉(zhuǎn)化到第2外顯子缺失的香稻材料中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的2-AP含量顯著下降，該研究結(jié)果表明第2外顯子上7個(gè)堿基的缺失也可引起水稻香味的產(chǎn)生。此外，隨著香味基因Badh2的克隆[6]，一系列Badh2等位變異基因被成功鑒定，相關(guān)的功能標(biāo)記也被開發(fā)利用[8-11]。近些年來研究人員希望通過生物技術(shù)手段對(duì)水稻品種中的香味基因進(jìn)行編輯，從而加快育種進(jìn)程。Niu等[12]通過RNAi技術(shù)，對(duì)日本晴中的香味基因BADH2進(jìn)行敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因后代植株中的香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量明顯增加；Chen等[13]采用人工小RNA轉(zhuǎn)基因技術(shù)，對(duì)日本晴中的香味基因BADH2進(jìn)行敲除，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因后代籽粒中2-AP含量明顯提高。轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）是基因組編輯核酸酶，可以有效地對(duì)靶向基因組進(jìn)行編輯，Shan等[14]通過TALEN技術(shù)，對(duì)水稻香味基因BADH2進(jìn)行基因組編輯，獲得了大約30%的雜合BADH2基因型的遺傳材料，通過后代分離鑒定，獲得剔除了轉(zhuǎn)基因克隆載體的香型突變體材料，突變體材料的2-AP含量明顯提高。

本研究利用CRISPR-CAS9技術(shù)，以中花11為研究對(duì)象，對(duì)水稻香味基因Badh2進(jìn)行編輯，獲得不攜帶轉(zhuǎn)基因克隆載體及表現(xiàn)出香味的植株，以期為加快水稻香味育種進(jìn)程提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究以中花11為遺傳轉(zhuǎn)化受體，開展常規(guī)的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因材料種植于中國(guó)水稻研究所富陽試驗(yàn)基地，常規(guī)田間種植及管理。

1.2載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因研究

利用試劑盒快速方便地將gRNA靶點(diǎn)序列插入到Cas9/gRNA質(zhì)粒中。構(gòu)建好的Cas9/gRNA質(zhì)粒能夠同時(shí)表達(dá)植物密碼子優(yōu)化的Cas9蛋白及gRNA，應(yīng)用CRISPR技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)基因的敲除和編輯，構(gòu)建載體及具體插入位置信息如圖1所示（北京唯尚立德生物科技有限公司）。

在油脂化學(xué)領(lǐng)域，與脂肪酸羧基相關(guān)的反應(yīng)是非?；A(chǔ)和重要的，其中很多工藝都被大量的運(yùn)用于日常生活當(dāng)中，比如酯化、酰胺化等反應(yīng)；也有一些幾乎不為人所知。所以有必要全面的加以了解，尤其是對(duì)其可發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)應(yīng)該具有一定的宏觀認(rèn)知，這樣有利于在創(chuàng)新上開闊思維，擴(kuò)展相關(guān)反應(yīng)在不同領(lǐng)域中的運(yùn)用。

圖1 Cas9/gRNA載體圖Fig. 1. Vector map of Cas9/gRNA.

1.3香味物質(zhì)測(cè)定

香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。測(cè)定過程中采用2,4,6-三甲基吡啶作為內(nèi)標(biāo)，將氣體成分以氦氣作為傳送媒介連續(xù)地注射到配置有光離子探測(cè)器的氣相色譜儀，氣相色譜儀與5975質(zhì)量選擇檢測(cè)器連接，其中采用一個(gè)HP-5MS色譜毛細(xì)管柱氣體樣品直接作為離子源，通過電子碰撞的模式起作用，最后經(jīng)由NIST2005檢測(cè)香氣物質(zhì)的峰值，2-AP的出峰時(shí)間為6.324 min。該方法樣品處理簡(jiǎn)單、快速、靈敏，樣本和試劑消耗少，能較容易地區(qū)分香稻和非香稻品種，降低了人為判斷香味的主觀性，提高了香味鑒定的準(zhǔn)確性，特別適合大批量香稻育種材料的鑒定，具體方法參考Shan等[14]，并作了相應(yīng)的改進(jìn)。

表1 本研究所使用的引物Table 1. List of primers used in this study.

1.4突變體表型分析

利用中花11及突變體材料，考查株高、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率及每穗粒數(shù)等產(chǎn)量性狀?？疾?個(gè)單株，獲得數(shù)據(jù)通過Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；千粒重的測(cè)定方法為數(shù)300粒種子并測(cè)定其質(zhì)量，8個(gè)重復(fù)。此外，還對(duì)直鏈淀粉含量，膠稠度及堿消值等三項(xiàng)蒸煮食味品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，3次重復(fù)，獲得的數(shù)據(jù)通過Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5PCR鑒定分析及qRT-PCR分析

分蘗盛期取參試材料單株葉片，采用CTAB法提取全基因組DNA，之后放置于-20℃冰箱中保存。然后將提取的DNA用于PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，PCR體系如下:DNA 5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1.5 μL，dNTPs（2 μmol/L）10 μL，2×緩沖液 25 μL，KOD Fx酶1 μL，加ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后EB溶液顯色并拍照，需要測(cè)序的樣品直接切膠回收送上海博尚生物技術(shù)有限公司。

利用RNA 提取試劑盒(Axygen)提取突變體和野生型葉片總RNA。 首先利用DNaseⅠ處理總RNA，接著以消化處理后的RNA為模板，采用cDNA 合成試劑盒(TOYOBO)反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，然后利用實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)方法分析Badh2在野生型和突變體中的表達(dá)量，其中Ubiquitin基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR體系如下: cDNA 模板1 μL，2×SYBR qPCR Mix (TOYOBO) 10 μL，正反引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序如下:95℃下預(yù)變性3 min，95℃下10 s，60℃下30 s，72℃下20 s，45個(gè)循環(huán)。利用公式2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1 結(jié)果與分析

2.1CRISPR-CAS9表達(dá)載體的構(gòu)建

通過對(duì)中花11編碼甜菜堿脫氫酶基因Badh2進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該基因開放閱讀框ORF序列與日本晴高度一致，屬于典型的非香型粳稻材料。此外，該材料在轉(zhuǎn)基因過程中由于其轉(zhuǎn)化效率高、生育期適中、結(jié)實(shí)率較高等優(yōu)點(diǎn)，因此，我們以中花11為轉(zhuǎn)基因受體，借助CRISPR/CAS9基因敲除技術(shù)開展轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。首先我們通過已知的香味基因Badh2登錄號(hào)LOC_Os08g32870，獲得了其全長(zhǎng)cDNA序列，結(jié)合http：//crispr.dbcls.jp/生物信息學(xué)網(wǎng)站，通過序列比對(duì)分析，在Badh2外顯子上找到一條長(zhǎng)度為20 bp特異性較好的靶點(diǎn)序列Target 1（表1， 圖2-A、B），將其構(gòu)建到表達(dá)載體中（圖1），并開展轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。

2.2Badh2的編輯及無標(biāo)記后代的鑒定分析

首先我們獲得了8個(gè)獨(dú)立的T0代轉(zhuǎn)基因植株，我們對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)基因苗提取相應(yīng)的DNA，同時(shí)在表達(dá)載體上設(shè)計(jì)特異性引物Vector-identify-F/R對(duì)靶點(diǎn)序列進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證（表1）。測(cè)序結(jié)果表明，我們驗(yàn)證了靶點(diǎn)序列的載體已成功插入到植物基因組，通過利用設(shè)計(jì)特異性測(cè)序引物Seq-F/R對(duì)Badh2靶點(diǎn)位置的基因組序列進(jìn)行了測(cè)序分析（表1）。結(jié)果表明，其中3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系材料在PAM附近發(fā)生了編輯，由于兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系沒有收到足夠的種子，因此僅對(duì)其中一個(gè)轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行了遺傳研究（圖2-C）。

圖2 Badh2及基因編輯Fig.2. Badh2 and its CRISPR-CAS9-mediated editing.

我們將T1代材料種植到轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)田，通過DNA提取及載體序列擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)載體在后代中發(fā)生了分離（圖2-D）。此外，我們進(jìn)一步對(duì)T1代植株Badh2進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)在Badh2第一外顯子上距離起始密碼子ATG下游18 bp位置插入一個(gè)堿基T，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的移碼，影響了Badh2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能（圖2-B）。通過對(duì)T120個(gè)單株Badh2編輯位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了該基因突變位點(diǎn)也發(fā)生了分離（圖2-E）。通過CRISPR-CAS9 技術(shù)對(duì)水稻中的香味基因進(jìn)行編輯，希望獲得剔除了載體骨架，同時(shí)還有香味的遺傳材料，結(jié)合載體序列PCR鑒定和Badh2靶點(diǎn)測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)單株3中的載體骨架已經(jīng)分離出去，而且還攜帶有突變形式的香味基因badh2(圖2-D、E)。

2.3轉(zhuǎn)基因后代Badh2 RNA水平檢測(cè)及香味物質(zhì)2-AP含量的測(cè)定

前期我們獲得了一個(gè)轉(zhuǎn)基因材料badh2，該材料中不包含載體序列且Badh2已被成功編輯，野生型與badh2表現(xiàn)出相似的植株表型(圖3-A)。此外，為了進(jìn)一步研究香味基因在轉(zhuǎn)基因后代中的功能，我們對(duì)中花11和突變體材料中Badh2 RNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。前人已報(bào)道水稻苗期葉片適合于Badh2 RNA 檢測(cè)[5]，因此我們提取了兩組材料苗期14 d左右葉片總RNA，然后通過qRT-PCR技術(shù)，對(duì)Badh2進(jìn)行了定量分析，我們發(fā)現(xiàn)突變體材料中Badh2表達(dá)水平顯著降低(圖3-B)。該結(jié)果表明香味基因第1外顯子一個(gè)核苷酸的插入，影響了該基因的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致該基因在突變體材料中表達(dá)顯著下調(diào)。

圖3 Badh2基因編輯后代表型及RNA表達(dá)水平的檢測(cè)Fig. 3. Phenotype and Badh2 RNA level of ZH11(Zhonghua 11) and badh2.

圖4 中花11及badh2中總離子色譜分析及香味物質(zhì)2-AP的含量Fig. 4. Total ion chromatograms(TIC) and 2-acetyl-1-pyrroline(2-AP)content of Zhonghua 11 and badh2.

與此同時(shí)，我們進(jìn)一步分析了該基因的突變及表達(dá)水平的降低是否與香味的產(chǎn)生相關(guān)。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)兩份材料中花11及突變體材料籽粒中的2-AP含量進(jìn)行了分析(圖4-A、B)，與野生型中花11對(duì)照相比，突變體材料中的香味物質(zhì)2-AP顯著提高，中花11中2-AP含量約0.07mg/kg，而突變體中則增加到1.2 mg/kg（圖4-C），因此，我們的結(jié)果表明Badh2突變是引起香味的一個(gè)關(guān)鍵基因。

圖5 水稻產(chǎn)量及蒸煮食味品質(zhì)在野生型及突變體材料中的表現(xiàn)Fig. 5. Performance of rice yield and cooking and eating quality in ZH11 and badh2.

2.4Badh2基因編輯后代產(chǎn)量性狀的考查及蒸煮食味品質(zhì)的測(cè)定

為了研究香味基因是否與水稻產(chǎn)量及稻米品質(zhì)密切相關(guān)，我們對(duì)中花11及其T2代突變體材料中的產(chǎn)量性狀及蒸煮食味品質(zhì)等幾項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了考查及測(cè)定。產(chǎn)量性狀主要包括株高、分蘗數(shù)、千粒重、每穗粒數(shù)及結(jié)實(shí)率，而蒸煮食味品質(zhì)主要包括直鏈淀粉含量、膠稠度及堿消值。通過生物統(tǒng)計(jì)分析，我們發(fā)現(xiàn)除了分蘗數(shù)及結(jié)實(shí)率在兩組材料中表現(xiàn)出顯著差異外(P＜0.05)，其余各項(xiàng)指標(biāo)間都無顯著差異(圖5)。因此，通過以上數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，推斷該基因并不影響稻米品質(zhì)，但是有可能影響水稻的產(chǎn)量。

3 討論

全球香稻資源豐富、栽培歷史悠久、種植范圍分布廣泛，印度的Basmati系列、泰國(guó)的KDML105、日本的宮香、美國(guó)的Della都是頗有名氣的香稻品種。我國(guó)也是香稻的主要種植區(qū)域，種植歷史悠久，各水稻主產(chǎn)區(qū)都有適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂虻脑枷愕绢愋?，如云南的螃蟹谷、貴州的香禾、廣西有靖西香糯等。實(shí)際生產(chǎn)過程中，傳統(tǒng)香稻存在地域性強(qiáng)、生育期長(zhǎng)、抗倒伏和抗病能力差、產(chǎn)量低等缺點(diǎn)，使得香稻的推廣和生產(chǎn)應(yīng)用受到了較大的限制[15]。傳統(tǒng)的香稻育種主要通過香型和非香型品種間雜交，由于后代分離植株香味鑒定的不確定性，以及香味基因可能與一些產(chǎn)量、品質(zhì)或抗病基因存在連鎖累贅，因此成功選育成香型優(yōu)良品種比較困難。

眾所周知，傳統(tǒng)香稻育種還是主要通過傳統(tǒng)的育種手段，品種間雜交及后代鑒定篩選，需要花費(fèi)大量時(shí)間和精力，因此，前人已嘗試通過轉(zhuǎn)基因的技術(shù)，直接對(duì)我們所培育品種中的香味基因Badh2進(jìn)行敲除或編輯，從而加快育種進(jìn)程[12-14]。CRISPR-CAS9系統(tǒng)是繼RNAi技術(shù)、鋅指核酸酶和TALEN核酸酶之后最新發(fā)展起來的另一個(gè)可精確定點(diǎn)編輯基因組DNA的新技術(shù)，其具有設(shè)計(jì)構(gòu)建簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)首先在動(dòng)物中廣泛利用，隨后科研人員將該技術(shù)應(yīng)用于植物基因組編輯。我們通過在Badh2基因ORF區(qū)域上設(shè)計(jì)特異性靶位點(diǎn)(圖2-A)，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因特異性敲除實(shí)驗(yàn)，成功獲得了一個(gè)攜帶有香味且剔除了載體序列的突變體材料badh2，該基因第一外顯子上發(fā)生了一個(gè)核苷酸T的插入(圖2-B)，不僅導(dǎo)致Badh2 RNA水平顯著降低(圖3-B)，而且引起了該蛋白質(zhì)的移碼，突變后的Badh2不能發(fā)揮正常蛋白功能，進(jìn)而導(dǎo)致了香味的產(chǎn)生(圖4-C)，由于該材料未攜帶轉(zhuǎn)基因元件，可直接應(yīng)用于育種研究，培育新的香型水稻材料，因此，利用該轉(zhuǎn)基因技術(shù)策略及特異性靶點(diǎn)，可以直接對(duì)不同水稻品種的Badh2進(jìn)行編輯，創(chuàng)制香型遺傳材料，這將大大加速香稻品種的選育進(jìn)程。

前人已報(bào)道香味基因與產(chǎn)量、品質(zhì)及抗病性存在一定的關(guān)系，我們通過對(duì)野生型材料中花11及轉(zhuǎn)基因后代材料的產(chǎn)量及品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)香味基因的變異與稻米品質(zhì)沒有表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，只有分蘗數(shù)和結(jié)實(shí)率兩項(xiàng)指標(biāo)在中花11及突變體材料中表現(xiàn)出顯著差異，株高、千粒重、每穗粒數(shù)以及三項(xiàng)蒸煮食味品質(zhì)指標(biāo)在兩組材料都無顯著差異(圖5)。轉(zhuǎn)基因植物容易導(dǎo)致植株變矮，分蘗數(shù)變少及結(jié)實(shí)率降低，所以我們推測(cè)該差異可能歸因于脫靶或轉(zhuǎn)基因過程中的組織培養(yǎng)，因此，我們目前將對(duì)突變體材料與野生型材料進(jìn)行回交，進(jìn)一步研究香味基因與分蘗數(shù)及結(jié)實(shí)率的關(guān)系。

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CRISPR/CAS9-mediated Editing of the Fragrant Gene Badh2 in Rice

SHAO Gaoneng, XIE Lihong, JIAO Guiai, WEI Xiangjin, SHENG Zhonghua, TANG Shaoqing*, HU Peisong*
(State Key Laboratory of Rice Biology, Key Laboratory of Rice Biology and Breeding of Ministry of Agriculture, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;*Corresponding author, E-mail: sqtang@126.com, hupeisong@caas.cn)

【Objective】Fragrant rice, which is favored because of its quality characteristics of faint scent and tastiness, is a special rice type. Fragrance in rice is mainly controlled by the gene encoding betaine aldehyde dehydrogenase on chromosome 8.【Method】The fragrant gene Badh2 in Zhonghua 11 was edited by CRISPR/CAS9.【Result】Twenty T1individuals derived from T0generation were genotyped. One plant, which contains an additional T base in the first exon of Badh2 without the vector skeleton, was finally produced. qRT-PCR result suggested that Badh2 RNA level was decreased in the mutant. Compared with the wild type, the mutant increased 2-acetyl-1-pyrroline content by the GC-MS method. Furthermore, two rice yield-related traits including tiller numbers and seed-setting rate showed significant difference at the 0.05 level among five traits related to yield and three traits related to cooking and eating quality.【Conclusion】We succeed editing the Badh2 by CRISPR-CAS9 technical in rice, and it would provide abundant theoretical guidance and accelerate the breeding process of fragrant rice.

rice; Badh2; CRISPR/CAS9; fragrance

Q755; S511.032

A

1001-7216(2017)02-0216-07

2016-06-20; 修改稿收到日期:2016-09-10。

國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際（地區(qū)）合作與交流項(xiàng)目(31161140348); 浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Y14C130040)。