王秀杰 ，邵新宇，施畢旻，國風(fēng)

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006)

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3例散發(fā)的2A型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病患者及其子代RET基因突變觀察

王秀杰 ，邵新宇，施畢旻，國風(fēng)

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006)

目的 觀察3例散發(fā)的2A型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病(MEN2A)患者及其子代的RET基因突變情況。方法 對3例MEN2A患者及其子代RET基因突變熱點區(qū)域的第10、11和16位外顯子進行直接測序。結(jié)果 病例1 RET基因第10位外顯子第618位密碼子TGC突變?yōu)門CC，該突變導(dǎo)致618位密碼子編碼的氨基酸由半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸(C618S)。病例2 RET基因第10位外顯子第618位密碼子TGC突變?yōu)锳GC，該突變導(dǎo)致618位密碼子編碼的氨基酸由半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸(C618S)。病例3 RET基因第11位外顯子中第634位密碼子TGC突變?yōu)镃GC，該突變導(dǎo)致634位密碼子編碼的氨基酸由半胱氨酸變?yōu)榫彼?C634R)。以上突變均為文獻已報道突變。3例患者子代無RET基因突變。結(jié)論 3例MEN2A患者RET基因突變發(fā)生在第10、11外顯子，其子代無RET基因突變。

多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病2A型；甲狀腺髓樣癌；嗜鉻細(xì)胞瘤；RET原癌基因；基因突變

多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病(MEN)為常染色體顯性遺傳病[1]，發(fā)病率約為1/30 000。原癌基因RET突變是多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病2型(MEN2)發(fā)病的基礎(chǔ)。MEN2是以甲狀腺髓樣癌、腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤和甲狀旁腺增生為主要特點的常染色體顯性遺傳性疾病，臨床上分為MEN2A、MEN2B和家族性甲狀腺髓樣癌3種亞型[2]。MEN2A主要表現(xiàn)為甲狀腺髓樣癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、甲狀旁腺功能亢進、皮膚淀粉樣變和先天性巨結(jié)腸；MEN2B主要表現(xiàn)為甲狀腺髓樣癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和口唇舌、胃腸道神經(jīng)瘤[3]。MEN2A占MEN2的75%，其中約90%伴有甲狀腺髓樣癌(MTC)，約50%伴有嗜鉻細(xì)胞瘤(PCC)，20%～30%伴有甲狀旁腺增生或腺瘤(HPT)[4]。以MTC或PCC為首發(fā)診斷的MEN2的漏診率仍較高，特別是疾病早期只有一種腫瘤表現(xiàn)時，容易被誤診為單內(nèi)分泌腺體腫瘤。分析MEN2患者RET基因突變的特點，對MEN2的診斷有重要臨床意義。本研究觀察了2009年1月～2015年12月收治的3例MEN2A患者的RET基因突變情況?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 病例1為女性，58歲，因“頸部占位”入院，查血清癌胚抗原(CEA)為40 ng/mL，降鈣素(CT)為442.26 pg/mg，于2009年9月行甲狀腺手術(shù)，術(shù)后病理證實為左側(cè)MTC。病例2為女性，35歲，因“陣發(fā)性頭痛胸悶心悸3年”入院，上述癥狀發(fā)作數(shù)分鐘后可自行緩解，發(fā)作后可出現(xiàn)面頰及皮膚潮紅伴大量出汗。體檢BP 187/99 mmHg，CT檢查示雙側(cè)腎上腺腫瘤，B超檢查示右側(cè)腎上腺占位。于2009年7月8日全麻下行腎上腺腫瘤切除術(shù)。術(shù)后病理報告為PCC。一年后，因“頸部占位”再次入院，查血清CT為372.94 pg/mg，CEA為40.6 ng/mL，于2010年10月行甲狀腺手術(shù)，術(shù)后病理提示左側(cè)MTC。患者既往有右股骨頸囊腫伴纖維組織增生。病例3為女性，39歲，初因“陣發(fā)性胸悶頭痛心悸3年”入院，查血清CEA為37.91 ng/mL，CT為360.56 ng/mL，B超示雙側(cè)腎上腺占位，于2011年11月17日行左側(cè)腎上腺腫瘤切除術(shù)，術(shù)后病理為腎上腺PCC。

1.2 RET基因測序方法 抽取患者靜脈血3 mL，用QIAampTMDNA FFPE Tissue試劑盒(OMEGA BI0-TEK公司)提取基因組DNA。取OD260/OD280為1.8～2.0的DNA樣品進行實驗。PCR擴增出RET原癌基因中發(fā)生突變率較高的第10、11、16外顯子的基因片段。第10外顯子上游引物序列為5′-GCGCCCCAGGAGGCTGAGTG-3′，下游引物序列為5′-CGTGGTGGTCCCGGCCGCC-3′，擴增產(chǎn)物長度為185 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第11外顯子上游引物序列為5′-GGTGCCAAGCCTCACACCAC-3′，下游引物序列為5′-ATCTTGAAGGCATCCACGGA-3′，擴增產(chǎn)物長度為272 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。第16外顯子上游引物序列為5′-AGGGATAGGGCCTGGGCTTC-3′，下游引物序列為5′-TAACCTCCACCCCAAGAGAG-3′，擴增產(chǎn)物長度為192 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。采用ABI 3730 DNA 全自動測序儀(Applied Biosystems公司)對擴增產(chǎn)物進行測序。發(fā)現(xiàn)突變點后將突變點與Cariff醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)院人類基因突變數(shù)據(jù)庫收錄的MEN2A相關(guān)的RET原癌基因突變進行對比。

2 結(jié)果

病例1 RET基因第10位外顯子第618位密碼子TGC突變?yōu)門CC，該突變導(dǎo)致618位密碼子編碼的氨基酸由半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸(C618S)。病例2 RET基因第10位外顯子第618位密碼子TGC突變?yōu)锳GC，該突變導(dǎo)致618位密碼子編碼的氨基酸由半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸(C618S)。病例3 RET基因第11位外顯子中第634位密碼子TGC突變?yōu)镃GC，該突變導(dǎo)致634位密碼子編碼的氨基酸由半胱氨酸變?yōu)榫彼?C634R)。以上突變均為文獻已報道突變。3例患者子代無RET基因突變。

3 討論

MEN2是由甲狀腺C細(xì)胞增生或MTC、腎上腺PCC和甲狀旁腺增生或腺瘤所組成的常染色體顯性遺傳性疾病，外顯率較高。2015年美國甲狀腺協(xié)會(ATA)發(fā)布的《甲狀腺髓樣癌管理指南修訂版》對MEN2A進行新的分類：①經(jīng)典型MEN2A,以MTC、PCC和(或)合并甲狀腺旁腺功能亢癥組成為特征；②伴隨皮膚苔蘚淀粉樣變的MEN2A；③伴隨先天性巨結(jié)腸的MEN2A；④家族性MTC[5]。

本研究3例患者RET基因測序均發(fā)現(xiàn)突變，其中2例為RET原癌基因的第10位外顯子上存在Cys(TGC)618Ser(TCC/AGC)錯義突變，1例為第11位外顯子上存在Cys(TGC)634Arg(CGC)錯義突變。病例1發(fā)病年齡58歲，首發(fā)MTC，血清CEA、CT均明顯升高，且RET原癌基因第10位外顯子上存在Cys(TGC)618Ser(TCC)錯義突變，故本例診斷為MEN2A明確。病例2發(fā)病年齡35歲，首發(fā)PCC，兩年后出現(xiàn)MTC，血清CEA、CT明顯升高，且RET原癌基因的第10位外顯子上存在Cys(TGC)618Ser(AGC)錯義突變，故MEN2A診斷明確，患者既往有右股骨頸囊腫伴纖維組織增生，是否與MEN2A相關(guān)尚需進一步研究。病例3發(fā)病年齡39歲，首發(fā)PCC，血清CEA、CT均升高，隨訪中出現(xiàn)甲狀旁腺功能亢進，存在常見的RET原癌基因第11位外顯子上Cys(TGC)634Arg(CGC)錯義突變，故診斷MEN2A明確。以上3例患者家系均未發(fā)現(xiàn)存在RET基因第10、11、16外顯子突變，故診斷為散發(fā)性MEN2A。

MTC是甲狀腺C細(xì)胞來源的惡性腫瘤，甲狀腺C細(xì)胞分泌的大量CT和CEA可作為MTC的標(biāo)志。MTC中70%～75%是散發(fā)性，其余為MEN2，包括MEN2A、MEN2B、家族性MTC(FMTC)[6]。與散發(fā)性MTC相比，遺傳性MTC常常為雙側(cè)、多病灶、與C細(xì)胞過度增生相關(guān)。對于獨立的MTC患者，或是MTC伴有腎上腺PCC或甲狀旁腺功能亢進者，起初可以篩查RET原癌基因第10、11、13、14、15、16位外顯子突變情況，若為陰性應(yīng)對完整的編碼區(qū)進行測序[7]。由于MEN2患者的主要死亡原因是MTC，一般出現(xiàn)在PCC之前，且對放射性碘、化療不敏感，早期手術(shù)切除突變基因攜帶者的甲狀腺可以很好地改善預(yù)后。對于遺傳性MTC患者，如果存在PCC和甲狀旁腺增生，應(yīng)先行PCC切除術(shù)，防止腎上腺危象的發(fā)生[2]。對于MTC的診斷和管理，北美神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤協(xié)會提出了指導(dǎo)建議：1級RET基因位點(密碼子609、768s、790、791、804、891)突變者的侵襲性最小，應(yīng)在10歲前行手術(shù)治療，但考慮到腫瘤變異和提早切除的有效率，多數(shù)專家建議在5歲時行預(yù)防性手術(shù)治療；2級RET基因位點(密碼子611、618、620、634突變)突變?yōu)楦呶Ｒ蛩兀颊邞?yīng)該在5歲前行甲狀腺切除術(shù)；3級RET基因位點(密碼子883、918、922)突變者侵襲性強，患者在出生時就會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，至少在出生6個月內(nèi)(最好在出生時)就行甲狀腺切除術(shù)[8]。目前國外臨床上已經(jīng)用RET基因測序代替血清CT檢側(cè)用以診斷MEN2攜帶者[9]。MEN2A兒童RET基因634密碼子發(fā)生突變，如果血清CT水平升高，應(yīng)該在5歲之前行預(yù)防性甲狀腺切除術(shù)[10]。

PCC是起源于神經(jīng)嵴的嗜鉻細(xì)胞腫瘤，腫瘤細(xì)胞合成和分泌兒茶酚胺引起陣發(fā)性或持續(xù)性高血壓及代謝紊亂綜合征。大多數(shù)MEN2中腎上腺PCC是良性的，累及雙側(cè)者高達80%[11]。MEN2患者的腎上腺PCC常常在MTC后出現(xiàn)，13%～30%的患者PCC單獨出現(xiàn)[12]。MEN2患者PCC轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒缘母怕蕿?%[13]。對于同時存在MTC和PCC的患者應(yīng)先行PCC切除術(shù)，防止發(fā)生威脅生命的嚴(yán)重并發(fā)癥，術(shù)后應(yīng)常規(guī)補充糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素。

RET基因定位于10q11.2,有21個外顯子，編碼一種酪氨酸激酶受體超家族的跨膜蛋白(TRK)，RET原癌基因突變可影響到TRK細(xì)胞外及細(xì)胞內(nèi)兩個區(qū)域，激發(fā)酪氨酸激酶自動磷酸化，進而活化有絲分裂原活化蛋白激酶途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞增生過度以致癌變。目前為止，超過95%的MEN2A家系存在第10、11位外顯子RET基因突變(約85%出現(xiàn)在634密碼子上)[14]，分別為第10位外顯子609、611、618、620密碼子上，第11位外顯子634密碼子上[2]。與MEN2相關(guān)的RET基因突變在RET基因的第8、10、11、13～16外顯子都有發(fā)現(xiàn)[4]。約50%的腎上腺PCC患者與RET原癌基因11號外顯子上的634、918位密碼子堿基替換有關(guān)；20%的腎上腺PCC患者與RET原癌基因10號外顯子上的609、611、618、620位密碼子堿基替換有關(guān);較罕見的為13～15號外顯子791、804位密碼子發(fā)生單個堿基替換[15]。本研究發(fā)現(xiàn)的突變?yōu)镽ET基因第11位外顯子634位密碼子由TGC變?yōu)镃GC(C634R)，是最常見的突變類型。國內(nèi)外文獻對于RET原癌基因第11位外顯子634密碼子突變已有C634R、C634Y、C634G的報道。在歐洲國家MEN2A家系約34%為634密碼子突變[16]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)與MEN2A相關(guān)的C634R突變表型的侵襲性要高于C634Y[17]。MEN2A和MEN2B分別對應(yīng)C634R和M918T突變具有較強侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，需要進行早期干預(yù)。MEN2A的不同表型與RET基因突變位點有很大關(guān)系。常規(guī)的基因檢測對于MEN的診斷和治療意義重大。

筆者認(rèn)為，對于首發(fā)MTC的MEN2A患者，應(yīng)定期檢測血尿間甲腎上腺素類物質(zhì)以排除PCC，每年檢測血鈣及甲狀旁腺激素以排除甲狀旁腺功能亢進。手術(shù)是MEN2的惟一的治療方式，對不能排除MEN2的患者，應(yīng)早期進行RET基因測序，一旦確診盡早進行預(yù)防性手術(shù)。

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蘇州市科技局項目(SYS201534，SS201219)。

邵新宇(E-mail：13052812075@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.027

R736

B

1002-266X(2017)27-0087-03

2017-03-06)