曹雷，鄭灼，李寧，趙訊，張穎軒

(哈勵遜國際和平醫(yī)院，河北衡水053000)

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急性腎損傷組織中細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)變化及其意義

曹雷，鄭灼，李寧，趙訊，張穎軒

(哈勵遜國際和平醫(yī)院，河北衡水053000)

目的 觀察細(xì)胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶4(CDK4)、p21在不同原因所致急性腎損傷(AKI)組織中的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 選擇行腎穿刺活檢術(shù)的患者納入研究，包括AKI患者108例和無器質(zhì)性腎臟病變的腎功能異常的患者(對照組)39例。AKI患者中，腎毒性AKI 63例(腎毒性AKI組)、缺血性AKI 45例(缺血性AKI組)。取各組腎穿刺活檢標(biāo)本，采用免疫組織法檢測Cyclin B1、CDK4、p21蛋白。結(jié)果 腎毒性AKI組、缺血性AKI組的腎小管細(xì)胞和腎間質(zhì)中p21、Cyclin B1、CDK4蛋白表達(dá)積分均高于對照組(P均<0.05)。腎毒性AKI組及缺血性AKI組腎組織中Cyclin B1、CDK4、p21蛋白表達(dá)積分相比，P均>0.05。結(jié)論 AKI組織中p21、Cyclin B1、CDK4蛋白表達(dá)上調(diào)，在腎毒性AKI和缺血性AKI中三種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)變化的趨勢一致；細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)與AKI病因無關(guān)。

急性腎損傷；細(xì)胞周期調(diào)控蛋白；細(xì)胞周期蛋白B1；細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶；細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑；p21蛋白

急性腎損傷(AKI)病情變化較快，是臨床常見的危急重癥[1，2]。AKI根據(jù)病因不同可分為缺血性AKI及腎毒性AKI兩種。缺血性AKI主要是由于腎臟灌注壓下降造成的，腎毒性AKI主要是由于化學(xué)物質(zhì)引起的腎毒性作用。細(xì)胞周期正調(diào)控蛋白包括細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)及細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)。p21蛋白為CDK抑制劑(CKI)家族中的一種，能夠廣譜抑制細(xì)胞周期正性調(diào)控蛋白的活性[3]。腎損傷等異常刺激作用使得有絲分裂原增加，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白異常表達(dá)，調(diào)控能力受限，從而造成腎臟結(jié)構(gòu)重塑及組織纖維化[4]。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)異常與AKI引起的腎臟細(xì)胞增生、肥大及凋亡密切相關(guān)[5]。相關(guān)研究[6]表明，細(xì)胞周期適當(dāng)?shù)淖铚軌蛴欣谝呀?jīng)損傷細(xì)胞的修復(fù)。本研究觀察了Cyclin B1、CDK4、p21在缺血性和腎毒性AKI組織中的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇在我院就診的需行腎穿刺活檢術(shù)的患者納入研究，患者既往無慢性腎功能不全病史，無孤立腎、小腎，無腎結(jié)核、腎周圍組織膿腫，無腎盂腎炎、腎盂積水或積膿，無腎腫瘤或腎動脈瘤，無多囊腎或腎臟大囊腫，無腎臟位置過高或游走腎，3個月內(nèi)均未使用激素進(jìn)行相關(guān)疾病的治療。共納入AKI患者108例和無器質(zhì)性腎臟病變的腎功能異?；颊?對照組)39例。AKI患者中，依據(jù)其病因、病史分為腎毒性AKI 63例(腎毒性AKI組)男31例、女32例，年齡(53.3±9.2)歲；缺血性AKI 45例(缺血性AKI組)男23例、女22例，年齡(53.6±6.7)歲。對照組39例，男19例、女20例，年齡(54.1±3.5)歲。三組患者性別比例、年齡資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 腎組織中Cyclin B1、p21、CDK4蛋白檢測 采用免疫組化法。取各組腎穿刺活檢標(biāo)本置于4 ℃、4%多聚甲醛溶液中固定2 h，常規(guī)乙醇梯度脫色，二甲苯透明、浸蠟、包埋。將常規(guī)石蠟連續(xù)切片(3 μm)烘干(60 ℃)8 h，浸入二甲苯Ⅱ、Ⅰ液中各10 min后經(jīng)梯度濃度乙醇水洗各3 min，使石蠟切片脫蠟至水。3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，蒸餾水中止3 min，PBS液浸泡5 min。微波修復(fù)抗原15 min，充分暴露抗原決定簇后自然冷卻。消除非特異性背景染色。滴加一抗，4 ℃冰箱過夜，PBS液沖洗3次、每次5 min。滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃，30 min，PBS液沖洗3次、每次5 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5～10 min，自來水充分沖洗以中止顯色反應(yīng)。蘇木素襯染3 min，水洗，1%鹽酸及99%乙醇分化20 s，充分水洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。用對照組腎組織標(biāo)本做陰性對照。根據(jù)染色程度和陽性細(xì)胞百分比判定免疫組化結(jié)果：細(xì)胞染色以胞核、胞質(zhì)或胞膜呈黃色為陽性，否則為陰性；根據(jù)染色程度為無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計0、1、2、3分；隨機選擇10個不重疊視野(400倍光鏡下)，每個視野各計數(shù)100個細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分比為0計0分、≤10%計l分、>10%～50%計2分、>50%～75%計3分、>75%～100%計4分；上述兩項得分相加，0分以上判定為蛋白表達(dá)陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。蛋白表達(dá)積分以中位數(shù)和百分位數(shù)(25%，75%)表示，等級資料組間比較用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

對照組腎組織中未見p21表達(dá)，但AKI組中可見p21染色呈棕黃色及棕褐色，其陽性細(xì)胞主要見于腎間質(zhì)、腎小球系膜細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞核及新月體內(nèi)，陽性細(xì)胞數(shù)占75%～90%。對照組腎小球及腎間質(zhì)內(nèi)Cyclin B1蛋白陽性染色呈棕褐色；AKI組腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞及腎間質(zhì)中可見Cyclin B1染色深度減弱。各組腎組織中CDK4表達(dá)與Cyclin B1表達(dá)情況相似，但對照組腎小球細(xì)胞中無CDK4陽性表達(dá)。腎毒性AKI組、缺血性AKI組的腎小管細(xì)胞和腎間質(zhì)中p21、Cyclin B1、CDK4蛋白表達(dá)積分均高于對照組(P均<0.05)。腎毒性AKI組及缺血性AKI組腎組織中Cyclin B1、CDK4、p21蛋白表達(dá)積分相比，P均>0.05。

表1 各組腎小管細(xì)胞及腎間質(zhì)中p21、Cyclin B1、CDK4蛋白表達(dá)積分比較(分)

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

AKI是慢性腎功能不全的常見病因[7,8]，以往對AKI的診斷金標(biāo)準(zhǔn)是SCr值升高，但SCr水平與患者的年齡、性別及機體代謝狀況等有關(guān)，其數(shù)值變化與AKI引起GFR的變化相比具有延遲性。腎組織細(xì)胞凋亡及腎小管上皮細(xì)胞急性壞死是腎毒性AKI及缺血性AKI的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)和主要病理改變[9]。腎小管上皮細(xì)胞是急性腎損傷的主要靶細(xì)胞，其增殖異常直接導(dǎo)致腎纖維化的發(fā)生與發(fā)展。研究[10]表明腎小管上皮細(xì)胞的再生和重建有利于受損腎臟組織修復(fù)。腎臟固有細(xì)胞為暫時休止細(xì)胞，病理因素或損傷因素產(chǎn)生的有絲分裂原使其活化進(jìn)入新的細(xì)胞周期[11]，而細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白在腎小管上皮細(xì)胞增殖、分化及凋亡中起著不可替代的作用。一個完整的細(xì)胞周期包括G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有絲分裂期)。細(xì)胞周期的每一時象均有其特異性的正負(fù)性調(diào)控蛋白。了解細(xì)胞周期調(diào)控蛋白在AKI發(fā)病中的作用機制有重要的臨床意義。

Cyclin B1在S期開始形成，G2/M期時達(dá)到高峰，是重要的細(xì)胞周期正性調(diào)控因子之一。研究[16]表明Cyclin B1能激活CDK1參與細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)換，Cyclin B1復(fù)合物又稱為成熟促進(jìn)因子(MPF)，能夠在無蛋白合成或被ede25e活化后促進(jìn)真核細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，其表達(dá)水平與AKI病變程度呈正相關(guān)。CDK是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶中的一種，其復(fù)合物形式是調(diào)控細(xì)胞周期的中心環(huán)節(jié)。CDK4是CDK家族的重要組成成員之一，對細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期起重要作用。然而，在外界不良刺激的作用下，Cyclin D1與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物，能夠激活CDK4并促使其下游的pRb蛋白磷酸化[13]，通過E2F轉(zhuǎn)錄子的釋放及活化，啟動信號系統(tǒng)，使細(xì)胞周期跨越關(guān)卡點，縮短細(xì)胞周期，引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控和細(xì)胞異常增殖[14]。在系膜增生型大鼠腎炎模型中CDK活性明顯升高，且Cyclins免疫染色程度增強。本研究結(jié)果顯示，AKI腎組織中Cyclin B1、CDK4陽性表達(dá)較強，且其表達(dá)變化與急性腎損傷中腎組織細(xì)胞的細(xì)胞周期分布變化基本一致。

p21蛋白也稱野生型p53激活片段，是一種細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，正常情況下野生型p53半衰期較短，免疫組化法通常檢測不出p21蛋白；但當(dāng)p53發(fā)生基因突變、半衰期延長，p21蛋白可以被檢出。p21能夠與Cyclin B1-CDK1及Cyclin D1-CDK4復(fù)合物相黏附，與其特異性結(jié)合并使其失活，從而使細(xì)胞周期(G1期向S期轉(zhuǎn)化)被阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有研究表明p21缺失的小鼠在注射順鉑后比野生鼠更迅速地出現(xiàn)急性腎衰竭癥狀，腎臟形態(tài)學(xué)損害更加嚴(yán)重。本研究中腎毒性AKI組、缺血性AKI組中均發(fā)現(xiàn)p21陽性表達(dá)水平顯著提高，較對照組的腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)中陽性表達(dá)明顯，推測p21陽性表達(dá)對腎損傷有一定的抑制作用，這可能與p21調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡平衡有關(guān)。

總之，雖然細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)及其功能執(zhí)行受多種因素影響及干擾，但在腎毒性AKI及缺血性AKI的病變發(fā)展中Cyclin B1、CDK4、p21蛋白的表達(dá)與其執(zhí)行的功能相一致。深入研究細(xì)胞周期調(diào)控蛋白在AKI中的作用，有助于了解AKI的發(fā)病機制，在病變早期進(jìn)行干預(yù)，控制病情進(jìn)展。

[1] Rewa O, Bagshaw SM. Acute kidney injury-epidemiology, outcomes and economic[J]. Nat Rev Nephrol, 2014,10(4):193-207.

[2] 陳智.急性腎損傷致遠(yuǎn)隔器官損傷[J].中華實用兒科臨床雜志,2015,30(5):323-324.

[3] 秦福芳,邵鳳民.細(xì)胞周期調(diào)控蛋白與腎臟疾病[J].醫(yī)藥論壇雜志,2011,32(23):205-206.

[4] 唐怡,張凌,付平.細(xì)胞凋亡與急性腎損傷[J].中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版),2014,6(9):5-8.

[5] Homsi E, Janino P, de Faria JB. Role of caspases on cell death, inflammation, and cell cycle in glycerol-induced acute renal failure[J]. Kidney Int, 2006,69(8):1385-1392.

[6] 沈云琳,黃文彥.急性腎損傷與細(xì)胞周期調(diào)控[J].國際兒科學(xué)雜志,2014,41(3):331-336.

[7] Goldstein SL. Acute kideny injury in children and its potential consequence in adulthood[J]. Blood Purif, 2012,33(1-3):131-137.

[8] Singbartl K, Kellum JA. AKI in the ICU:definition, epidemiology,risk stracification,and outcomes[J]. Kidney Int, 2012,81(9):819-825.

[9] 林婷,莊永澤.細(xì)胞周期調(diào)控蛋白在腎臟疾病中的表達(dá)及意義[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2010,11(8):743-746.

[10] 龍超,吳明正,何迷,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腎損傷的修復(fù)理論及歸巢機制的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2015,21(21):3852-3855.

[11] Obaya AJ, SedivyJM. Regulation of cyclin-CDK activity in mammalian cells[J]. Cell Mol Life Sci, 2002,59(1):126-142.

[12] May M, Wang T, Muller M, et al. Difference in F-Actin depolymerization induced by toxin B from the variant clostridium difficile serotype F striain 1470[J]. Toxins(Basel), 2013,5(1):106-119.

[13] Ehrenthal DB, Jurkovitz C, Hoffman M, et al. Prepregnancy body mass index as an independent risk factor for pregnancy-induced hypertension[J]. J Womens Health, 2011,20(1):67-72.

[14] 金文虎,王達(dá)利,聶開瑜,等.增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中CyclinD1, CDK2,CDK4作用及與細(xì)胞周期的相關(guān)性[J].中國組織工程研究,2012,16(24):4422-4426.

河北省自然科學(xué)基金項目(20150431)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.025

R365

B

1002-266X(2017)27-0082-03

2017-03-08)