李亞麗，孫艷美，張寧，王方娜，高健

(河北省人民醫(yī)院，石家莊050071)

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1例疑診Leigh綜合征患兒及其父母線粒體相關(guān)基因突變觀察

李亞麗，孫艷美，張寧，王方娜，高健

(河北省人民醫(yī)院，石家莊050071)

目的 觀察并分析1例疑診Leigh綜合征患兒及其父母的線粒體相關(guān)基因突變情況。方法 發(fā)育落后合并肌張力異常、疑診Leigh綜合征的患兒1例，3歲，患兒就診時其母孕14周。采集患兒及其父母的外周血2 mL，提取血液基因組DNA，采用高通量測序分析檢測患兒線粒體病相關(guān)基因，并觀察其父母基因突變情況。根據(jù)檢測出的患兒線粒體相關(guān)基因突變位點，在患兒母親孕18周時抽取羊水，采用PCR法檢測胎兒是否存在相同突變位點，分析胎兒患病的風(fēng)險。結(jié)果 測得患兒過量位點蛋白1(SURF1)基因有兩個突變位點c.655G>T(p.E219X)和c.324-1G>C，c.655G>T來源于母親、c.324-1G>C來源于父親，為復(fù)合雜合突變，確診患兒為疑診Leigh綜合征?；純耗赣H羊水PCR檢測分析發(fā)現(xiàn)胎兒為c.324-1G>C突變，無c.655G>T突變，為雜合突變攜帶者，胎兒出生后隨訪至1歲，孩子身體健康，能平穩(wěn)獨自行走。結(jié)論 發(fā)現(xiàn)Leigh綜合征患兒SURF1基因的兩個突變位點c.655G>T(p.E219X)、c.324-1G>C，是患兒發(fā)育落后、肌張力異常的致病基因；患兒父母均為雜合基因突變攜帶者，遺傳方式是常染色體隱性遺傳，母親每次受孕其胎兒患病概率為25%。

線粒體肌?。籐eigh綜合征；過量位點蛋白1基因；基因突變；常染色體隱性遺傳

線粒體是真核細(xì)胞中的一種細(xì)胞器，它是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場所，為細(xì)胞95%的活動提供所需能量，并且它還參與細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程，有調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的能力。線粒體有自身的遺傳物質(zhì)和遺傳體系，線粒體基因約編碼人類2%的蛋白質(zhì)[1]。線粒體肌病是由于線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常造成細(xì)胞呼吸鏈及能量代謝障礙的臨床綜合征，當(dāng)其伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀時稱為線粒體腦肌病。線粒體肌病較常見的一種臨床類型是Leigh綜合征(LS)，多發(fā)生于嬰幼兒或兒童期，起病較隱匿，呈慢性進(jìn)行性的肌張力倒退、伴隨運動和智力發(fā)育遲緩，部分患者可出現(xiàn)呼吸衰竭、運動障礙而危及生命。早期診斷和治療LS非常重要。該病臨床表現(xiàn)多樣，單純依靠臨床表現(xiàn)和一般實驗室檢查很難準(zhǔn)確診斷，目前診斷該病的金標(biāo)準(zhǔn)是基因診斷[2～4]。本研究回顧分析了對1例臨床疑似LS患兒的分子遺傳學(xué)研究過程，發(fā)現(xiàn)了過量位點蛋白1(SURF1)基因的兩個新的突變位點，明確了診斷和病因，并對其母孕期進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 疑似LS患兒1例，女，3歲，發(fā)育落后。生后9個月始能獨坐，1歲3個月可以扶走，扶走時雙下肢抬起困難，至今不能獨自站立和行走；僅能簡單發(fā)音“爸爸、媽媽”；1歲3個月運動倒退，四肢無力，嘔吐、喂養(yǎng)困難，易哭鬧、睡眠差，血乳酸3.0 mm/L；頭MRI檢查示雙側(cè)基底節(jié)區(qū)及腦干異常信號，部分病變彌散受限。根據(jù)患兒臨床癥狀和檢驗結(jié)果疑診LS?；純焊改竿g(25歲)，身體均健康，否認(rèn)家族中有遺傳病史?；純耗赣H25歲，23歲足月順產(chǎn)此患兒，為第1次孕產(chǎn)，患兒生后Apgar評分正常?；純耗赣H現(xiàn)孕14周，為避免再次生育此類患兒，要求行產(chǎn)前診斷。

1.2 線粒體相關(guān)基因突變觀察 采集患兒及其父母的外周血2 mL(EDTA抗凝)，按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA(天根試劑盒)。以電泳和NanoDrop超微量分光光度計檢測DNA的質(zhì)量和濃度。提取1 500 ng的基因組DNA，超聲打斷成平均300 bp的長度，進(jìn)行文庫構(gòu)建；連接8 bp的index標(biāo)簽和接頭到打斷的DNA上；連接好接頭的片段化DNA與內(nèi)分泌疾病捕獲芯片進(jìn)行雜交捕獲；捕獲后的文庫質(zhì)量和濃度通過片段分析和定量PCR進(jìn)行評估。上illumina HiSeq X ten平臺測序，基因組中佝僂病相關(guān)基因的測序數(shù)據(jù)量在2 G左右，平均測序深度在100 X。測序數(shù)據(jù)通過NextGENe軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾和比對分析。篩選的突變點在數(shù)據(jù)庫(dbSNP、ExAC和1000 genome projects)中比對來確定人群攜帶率，進(jìn)一步判斷其致病性；通過SIFT、Polyphen-2 and mutation taster等軟件進(jìn)行突變點保守性及致病性分析，預(yù)測其致病性。對疑似致病的突變位點，通過一代測序進(jìn)行驗證，測序結(jié)果借助Mutation Surveyor v4.0軟件與參考序列進(jìn)行比對。

1.3 患兒母親羊水細(xì)胞中線粒體相關(guān)基因突變觀察 患兒母親于孕18周時抽取羊水，采用PCR法檢測胎兒是否存在相同突變位點，進(jìn)行產(chǎn)前診斷。于產(chǎn)后1年對胎兒出生后的情況進(jìn)行隨訪。

2 結(jié)果

測得患兒SURF1基因有兩個突變位點c.655G>T(p.E219X)和c.324-1G>C，c.655G>T來源于母親、c.324-1G>C來源于父親，為復(fù)合雜合突變(見圖1、2)，確診患兒為LS。患兒母親羊水PCR檢測分析發(fā)現(xiàn)胎兒存在c.324-1G>C突變，未發(fā)現(xiàn)c.655G>T突變，為雜合突變攜帶者(見圖1、2)?；純耗赣H足月順產(chǎn)一男嬰，現(xiàn)已1歲，身體健康，能平穩(wěn)獨自行走。

注：1為患兒樣本；2為患兒父親樣本；3為患兒母親樣本；4為羊水細(xì)胞樣本；黑色箭頭示SURF1基因突變位點c.655G>T(p.E219X)；白色箭頭處SURF1基因不存在突變位點c.655G>T(p.E219X)。

圖1 SURF1基因突變位點c.655G>T(p.E219X)

3 討論

LS最早由英國學(xué)者[5]發(fā)現(xiàn)并描述其神經(jīng)病理學(xué)特征。LS是多種酶缺陷導(dǎo)致的線粒體呼吸鏈氧化磷酸化障礙，引起退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，其特征是腦干、基底節(jié)和脊髓后柱區(qū)有對稱性局灶壞死，故又稱為亞急性壞死性腦脊髓病[6，7]。LS病因復(fù)雜，臨床發(fā)病率約1/40 000。LS按患者發(fā)病年齡可分為三種類型，即新生兒型、經(jīng)典嬰兒型、青少年型。其中以嬰兒型最常見，臨床表現(xiàn)不一，包括運動和智力低下(包括舞蹈癥)、肌張力減退、痙攣、小腦共濟(jì)失調(diào)等，發(fā)病后2年內(nèi)病死率高[8～10]。LS患者血清或腦脊液中乳酸含量增高[11～12]。祝小芬等[13]研究認(rèn)為靜息時乳酸升高、運動后即刻超過正常值3倍可作為擬診LS的參考。LS頭部MRI檢查特征性表現(xiàn)是基底節(jié)尤其殼核區(qū)可見多灶性、雙側(cè)對稱性的腦軟化灶。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)LS患者丘腦、基底節(jié)、腦室、大腦導(dǎo)水管周圍和脊髓后柱區(qū)有對稱性局灶壞死，呈海綿狀囊樣空腔，并伴有脫髓鞘改變、血管增生和神經(jīng)膠質(zhì)增生[14]。LS具有復(fù)雜的臨床表現(xiàn)和基因調(diào)控機(jī)制，為嚴(yán)重的致死性遺傳病，且目前無有效治療措施，故產(chǎn)前診斷是一項重要預(yù)防措施。

注：1為患兒樣本；2為患兒父親樣本；3為患兒母親樣本；4為羊水細(xì)胞樣本；黑色箭頭示SURF1基因存在突變位點c.324-1G>C，c.655G>T；白色箭頭處SURF1基因不存在突變位點c.324-1G>C，c.655G>T。

圖2 SURF1基因突變位點c.324-1G>C，c.655G>T

LS主要有3種遺傳方式：線粒體遺傳(又稱母系遺傳)，由線粒體基因突變引起；常染色體隱性遺傳；X-連鎖遺傳。后兩種遺傳方式是核基因突變所致，其中常染色體隱性遺傳最為常見，約占60%。目前發(fā)現(xiàn)約10種類型核基因突變引起線粒體病，包括呼吸鏈復(fù)合物亞基及組裝因子突變，維持線粒體基因穩(wěn)定性的突變，線粒體蛋白組合裝置缺陷，線粒體脂質(zhì)環(huán)境缺陷，線粒體運輸裝置缺陷，輔酶Q10缺乏，線粒體網(wǎng)絡(luò)動態(tài)學(xué)缺陷，凋亡缺陷，丙酮酸脫氫酶缺陷和線粒體鐵代謝障礙[3]。呼吸鏈復(fù)合物亞基及組裝因子突變基因達(dá)51個[15]。研究[16，17]發(fā)現(xiàn)常染色體隱性遺傳與4種呼吸鏈酶缺陷有關(guān)，即復(fù)合物Ⅰ(NADH還原酶)、復(fù)合物Ⅱ(琥珀酸脫氫酶)、復(fù)合物Ⅳ(COX)、復(fù)合物Ⅴ(ATP合成酶)。其中最為常見是復(fù)合物Ⅳ的缺陷。COX復(fù)合物由13個多肽亞單位組成，其中10個由核基因編碼(SURF1、SCO1、SCO2、COX10、COX15、COX20、LRPPRC、FASTKD2、TACO1、PET100等)，其余3個由線粒體基因編碼[18，19]。LS最常見的致病基因是SURF1，位于9q34.2，有9個外顯子，全長4 695 bp。SURF1基因編碼的蛋白含有300個氨基酸殘基(AA)，有2個跨膜結(jié)構(gòu)域(61～79AA、274～290AA)。SURF1蛋白在COX復(fù)合物的裝配前期中發(fā)揮十分重要的作用。迄今國外報道已發(fā)現(xiàn)40多例LS患者存在SURF1基因突變[20]；國內(nèi)共報道了6例，1例為622delA和653 -654delCT缺失，5例為外顯子7的604位G>C雜合錯義突變。

本研究中患兒發(fā)育落后，不能獨走，扶走時雙下肢抬起困難，2歲后活動能力有倒退；血乳酸3.0 mmol/L；頭部MRI檢查示雙側(cè)基底節(jié)區(qū)及腦干異常信號，部分病變彌散受限，符合LS的臨床特征，擬診斷為LS。進(jìn)行二代測序篩查基因發(fā)現(xiàn)患兒SURF1基因有c.655G>T(p.E219X)及c.324-1G>C復(fù)合雜合突變，與PubMed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)所屬的SNP數(shù)據(jù)庫、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)中已公布的SURF1基因突變位點相比，這兩個突變均未見報道。上述兩個突變中，前者為無義突變，后者為剪切突變，理論上均具有致病性。故我們認(rèn)為這兩種缺失突變?yōu)樾碌闹虏⊥蛔?。傳遞分析表明，患兒母親存在SURF1基因c.655G>T雜合突變，父親有SURF1基因c.324-1G>C雜合突變，明確了診斷和致病基因，不僅為患兒的治療提供了準(zhǔn)確依據(jù)，而且根據(jù)患兒致病SURF1基因及其父母基因比對，發(fā)現(xiàn)患兒父母親均為致病基因攜帶者，遺傳方式是常染色體隱性遺傳，故患兒父母再次生育時，其子女患病概率為25%，需進(jìn)行產(chǎn)前診斷。本例患兒母親在孕18周時進(jìn)行羊水細(xì)胞PCR檢測，發(fā)現(xiàn)胎兒有c.324-1G>C突變，沒有c.655G>T突變，為雜合突變攜帶者，理論上不具致病性，故保留此胎兒，產(chǎn)后隨訪至1歲，孩子未出現(xiàn)異常。

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