劉媛媛

HPLC法測(cè)定不同采收期茵陳中綠原酸和咖啡酸的含量

劉媛媛

（江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部，南京210019）

目的用HPLC法測(cè)定不同采收期2、3、4、5、6、7、8、9、10、11月份采集的茵陳樣品中綠原酸和咖啡酸的含量，為確定其合適的采收季節(jié)提供理論依據(jù)。方法收集不同采收期2、3、4、5、6、7、8、9、10、11月份采收的茵陳樣品。采用Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.3%磷酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；柱溫：30℃；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長：325 nm。結(jié)果綠原酸和咖啡酸均在一定濃度內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。不同采收期茵陳樣品中綠原酸的含量均高于咖啡酸的含量，綠原酸在4月份達(dá)到峰值，咖啡酸在5月份達(dá)到峰值，并且春季樣品含量明顯優(yōu)于其他時(shí)間采收期。結(jié)論茵陳同一入藥部位不同采收期綠原酸和咖啡酸的含量均會(huì)發(fā)生變化，綜合考慮4~5月份為茵陳的最佳采收期。該含量測(cè)定方法穩(wěn)定、有效，可為茵陳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

茵陳；HPLC；綠原酸；咖啡酸

茵陳，別名牛至、田耐里、因塵、馬先、綿茵陳、絨蒿、白蒿、細(xì)葉青蒿、安呂草，為菊科植物濱蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陳蒿Artemisia capillaries Thumb.的干燥地上部分。全國各地均有分布。主產(chǎn)于四川、河北、山西等省。商品通稱綿茵陳，陜西產(chǎn)者稱西茵陳，質(zhì)量最佳。性苦、辛，微涼。歸脾、胃、肝、膽經(jīng)。茵陳具有清利濕熱，利膽退黃之功。主治：黃疸、小便不利、濕瘡瘙癢、傳染性黃疸型肝炎。用于黃疸尿少，濕溫暑濕，濕瘡瘙癢。現(xiàn)代研究表明，茵陳主要含有有機(jī)酸、黃酮、香豆素、烯炔等化學(xué)成分，其中綠原酸和咖啡酸為茵陳的主要成分之一，綠原酸具有廣泛的生物活性，現(xiàn)代科學(xué)對(duì)綠原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、醫(yī)藥和日用化工等多個(gè)領(lǐng)域。綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[1]?？Х人峋哂锌咕共《?，中樞興奮，解毒，凝血的作用。茵陳于春季幼苗高6～10 cm時(shí)采收或秋季花蕾長成至花初開時(shí)采割，除去雜質(zhì)及老莖，曬干。介于茵陳有兩個(gè)采收期，春季和秋季采收，春季采的習(xí)稱“綿茵陳”；秋季采的習(xí)稱“茵陳蒿”。所以本實(shí)驗(yàn)將采用HPLC方法反相色譜，測(cè)定不同采收期茵陳中綠原酸和咖啡酸的含量，為茵陳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[2]。

1 儀器與材料

1.1 儀器高效液相色譜儀：美國安捷倫1260高效液相色譜儀（美國惠普公司）：包括DEABL00204低壓四元泵；DEAAK03494柱溫箱；DEAAN00315自動(dòng)進(jìn)樣器；DEAAX00613紫外檢測(cè)器）；色譜柱：安捷倫Hedera ODS-3；Size:250 mm×4.6 mm，5 μm。

其他設(shè)備：BP112型電子天平（德國satorius公司）；Millipore超純水制備系統(tǒng)(美國）。

1.2 試藥綠原酸對(duì)照品（111831-201001中國藥品生物制品檢定所提供）；咖啡酸對(duì)照品（110885-200102中國藥品生物制品檢定所提供）；茵陳樣品均來自于陜西，分別為10個(gè)不同采收期2~11月份，經(jīng)鑒定為科植物濱蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陳蒿Artemisia capillaries Thumb.的干燥地上部分（見表1）；乙腈（Tedia美國，色譜純）；甲醇（上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；冰乙酸（上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；雙蒸水實(shí)驗(yàn)室制備并經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾。

表1 茵陳樣品信息來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A乙腈-B0.3%磷酸水進(jìn)行梯度洗脫（見表2）；柱溫：30℃；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長：325 nm[3-4]。結(jié)果見圖A、B。

表2 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱定綠原酸、咖啡酸對(duì)照品1.056 mg、1.134 mg，以甲醇定容在10 ml棕色容量瓶中，再分別吸取已經(jīng)定容的綠原酸和咖啡酸對(duì)照品溶液各4 ml，以甲醇稀釋定容在10 ml的棕色容量瓶中，得到濃度為綠原酸42.24 μg/ml、咖啡酸45.36 μg/ml的對(duì)照品混標(biāo)溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備精密稱定10批不同采收期的茵陳樣品粗粉2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%的甲醇50 ml，加熱回流提取2次，每次1 h，過濾，合并兩次濾液，蒸干，以甲醇溶解殘?jiān)?，定容?0 ml棕色容量瓶中，4℃冰箱避光保存?zhèn)溆?，使用前?.45 μm濾膜過濾。

圖A混標(biāo)對(duì)照品HPLC圖

圖B供試品溶液HPLC圖

2.4 線性關(guān)系的考察按上述色譜條件分別進(jìn)樣對(duì)照品混標(biāo)溶液5 μl、8 μl、10 μl、15 μl、20 μl，記錄峰面積與對(duì)照品濃度計(jì)算回歸方程得分別為綠原酸、咖啡酸，濃度范圍見表3。

表3 綠原酸、咖啡酸線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn)精密吸取同一濃度混標(biāo)溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μl，根據(jù)峰面積，計(jì)算綠原酸和咖啡酸的RSD分別為0.12%、0.08%（n= 6），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一濃度的混標(biāo)溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h分別進(jìn)樣，按上述色譜條件每次進(jìn)樣10 μl，根據(jù)峰面積，計(jì)算綠原酸和咖啡酸的RSD分別為2.14、1.19%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批供試品2 g精密稱定，平行制備6份，按色譜條件下進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μl，根據(jù)峰面積與對(duì)照品濃度，計(jì)算樣品中的綠原酸和咖啡酸含量。所得結(jié)果綠原酸含量RSD為1.23%、咖啡酸含量RSD為1.58%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)取同一批供試品2 g共6份，精密稱定，平行制備，分別加入一定濃度的綠原酸、咖啡酸混標(biāo)對(duì)照品溶液，按上述上述色譜條件相同條件進(jìn)行樣品處理和進(jìn)樣分析得到綠原酸、咖啡酸含量。進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定，根據(jù)結(jié)果計(jì)算RSD分別為綠原酸99.12%、100.23%、100.72%、99.83%、101.52%、100.21%；咖啡酸100.57%、99.23%、99.92%、99.63%、98.99%、99.95%。結(jié)果顯示，回收率良好。

2.9 樣品的含量測(cè)定見表4。本實(shí)驗(yàn)收集了來自同一產(chǎn)地(陜西)，全年不同月份所采收的茵陳，按照上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。

表4 同年不同時(shí)間采收茵陳綠原酸、咖啡酸含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果本實(shí)驗(yàn)采用HPLC方法對(duì)不同采收期的茵陳進(jìn)行了綠原酸和咖啡酸的含量測(cè)定，結(jié)果顯示，出自同一產(chǎn)地不同采收期的茵陳其兩種目標(biāo)性化合物的含量隨著季節(jié)的變換而發(fā)生改變，總體來說綠原酸含量在各個(gè)不同采收期均高于咖啡酸的含量，同年4~5月份采收的茵陳綠原酸和咖啡酸的含量均較高，由此可以認(rèn)為全年4~5月為茵陳的最佳采收期。此外，尤其兩種成分含量差異較大，所以綠原酸和咖啡酸只能作為評(píng)價(jià)茵陳質(zhì)量的指標(biāo)性成分之一，而不能全面評(píng)價(jià)茵陳的質(zhì)量好壞。

3.2 討論按本文中的檢測(cè)方法，均能使目標(biāo)性成分綠原酸和咖啡酸達(dá)到完全分離，并且基線平穩(wěn)，能較好對(duì)綠原酸和咖啡酸進(jìn)行定性和定量，系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)顯示結(jié)果較好。同時(shí)也考察了不同的流動(dòng)相對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，分別是乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.3%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.3%四種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)磷酸洗脫的峰形明顯優(yōu)于甲酸，0.3%的磷酸峰形優(yōu)于0.1%的磷酸，所以本實(shí)驗(yàn)選擇了乙腈-0.3%磷酸進(jìn)行梯度洗脫。由于綠原酸的最大吸收波長為327 nm，咖啡酸的最大吸收波長為320 nm，結(jié)合綜合因素，所以選擇了325 nm為檢測(cè)波長。并且進(jìn)行了多種方法學(xué)考察，證明使用該方法進(jìn)行測(cè)定穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好。

[1]謝韜，梁敬鈺，劉凈.茵陳化學(xué)成分和藥理作用現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2007，1(1):23-25.

[2]王如意，歐喬英，周偉明.十批茵陳中藥材的質(zhì)量分析研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2015，28(4):737-738.

[3]黃志恒.HPLC法測(cè)定蒲公英中綠原酸、咖啡酸及阿魏酸的含量[J].中國民族民間醫(yī)藥，2014，22(2):21-23.

[4]舒詳，陳軍，林世和，等.白英不同生長期不同藥用部位綠原酸與咖啡酸及蘆丁含量測(cè)定[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31(8):1062-1064.

Content Determination of Chlorogenic Acid and Caffeic Acid in Virgate Wormwood Herb in Different Harvest Periods by HPLC Method

LIU Yuanyuan
(Pharmaceutical Department,Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210019,China)

Objective Determination of different harvest period in February,March,April,May,June,July,August,September,October,November of chlorogenic acid and caffeic acid in virgate wormwood herb sample by HPLC method,to provide a theoretical basis for determining the appropriate harvest season.Methods The different harvest period in February,March,April,May,June,July, August,September,October,November of chlorogenic acid and caffeic acid in virgate wormwood herb sample was collected.The Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5μm)chromatographic column was used,0.3%acetonitrile-phosphate water as mobile phase in gradient elution.Column temperature was 30℃.Flow rate was 1.0 ml/min.The detection wavelength was 325 nm.Results The chlorogenic acid and caffeic acid had good linear relationship within a certain concentration.In different harvest time,the content of chlorogenic acid was higher than that of caffeic acid.The chlorogenic acid reached peak in April peak,and caffeic acid reached peak in May.The spring sample content was better than the rest of the year.Conclusion The different harvest time of virgate wormwood herb on the same section as the content of chlorogenic acid and caffeic acid changed.Through considering,the best harvest time is April and May.The content determination method is stable and effective,and can be applied to assess the quality standard of virgate wormwood herb.

virgate wormwood herb;HPLC;chlorogenic acid;caffeic acid

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.07.064

1672-2779（2017）-07-0139-03

：李海燕本文校對(duì)：付金柏

2016-12-23）