王槐高，孔霞，郭向華，顧帝水，李彬彬，周艷芳

（廣東醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東東莞 523808）

口蝦蛄總生物堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)研究

王槐高，孔霞，郭向華，顧帝水，李彬彬，周艷芳

（廣東醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東東莞 523808）

目的探討口蝦蛄總生物堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抗瘤效果。方法口蝦蛄酸提堿沉，繼以乙酸乙酯萃?。籆CK-8法測(cè)定不同質(zhì)量濃度的口蝦蛄總生物堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用；平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)HepG2細(xì)胞克隆形成能力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其刺激HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。結(jié)果口蝦蛄總生物堿作用于HepG2細(xì)胞24，48，72 h后，CCK－8法檢測(cè)細(xì)胞活性的半抑制濃度（IC50）分別為746.72，47.58，26.32 g／mL；口蝦蛄總生物堿（0，10，50，100 g／mL）作用2周后，各組細(xì)胞克隆形成率分別為56.1%，35.7%，14.1%，0；口蝦蛄總生物堿作用48 h后，HepG2細(xì)胞周期的S期比例由26.14%上升為40.80%。結(jié)論口蝦蛄總生物堿能明顯抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，這可能通過阻滯細(xì)胞周期來實(shí)現(xiàn)。

口蝦蛄；總生物堿；人肝癌HepG2細(xì)胞；細(xì)胞；CCX-8法；平板克隆形成試驗(yàn)；細(xì)胞周期

肝癌發(fā)病率高居全世界第6位，惡性腫瘤死因的第3位[1－2]，為嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤。原發(fā)性肝癌起病隱襲，癥狀、體征出現(xiàn)較晚，患者就診時(shí)往往已屬中晚期，且多數(shù)伴有肝硬化，僅有部分患者能獲得手術(shù)治療機(jī)會(huì)。因肝癌早期無癥狀，惡性程度高，病情變化快，生存期短，病死率高，故被稱為“癌中之王”。近年來，我國肝癌發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，除了提高肝癌的早期診斷率外，抗肝癌新藥的研究開發(fā)及應(yīng)用也顯得尤為迫切。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄提取物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用[3－5]。本研究中在前期研究的基礎(chǔ)上，改進(jìn)提取分離方法，得到總生物堿，并采用CCK－8法、平板克隆法及流式細(xì)胞術(shù)法，探討口蝦蛄總生物堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，為進(jìn)一步開發(fā)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物

新鮮口蝦蛄（經(jīng)鑒定屬節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱口足目蝦蛄科品種）絞碎，以水加濃鹽酸浸泡過夜，離心，取上清液，調(diào)入濃氨水堿化至pH＞10；上清液及離心后的沉淀分別以乙酸乙酯分次萃取，減壓濃縮分別得水提取物（簡(jiǎn)稱L）及沉淀提取物（即總生物堿，簡(jiǎn)稱S）[5]。各提取物分別用二甲基亞砜(DMSO)溶解，分裝于4℃冰箱保存。臨用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋成所需質(zhì)量濃度，并使各組分中DMSO的終濃度不超過0.1%。

1.1.2 細(xì)胞株

人肝癌HepG2細(xì)胞(廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所)，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（GIBCO公司）；小牛血清（四季青生物材料工程公司）；Cell Counting Kit－8（CCK－8，日本同仁株式會(huì)社化學(xué)研究所）；DMSO（Sigma公司）；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器

CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Synergy2型多功能酶標(biāo)儀（美國BioTEK公司）；FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 CCK－8法檢測(cè)L及S對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為3×104個(gè)／mL，96孔培養(yǎng)板每孔100 μL細(xì)胞懸液（3×103個(gè)／孔），將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2、飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)24 h。再分別加入L和S使終質(zhì)量濃度分別為0.1，1.0，10.0，100.0，1 000.0 μg／mL，分別培養(yǎng)24 h和48 h后，終止培養(yǎng)前1 h，每孔加入CCK－8溶液，混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h后，于酶標(biāo)儀上450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度(OD)值，按試劑盒說明書計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組OD值／對(duì)照組OD值）×100%。采用Bliss法分別計(jì)算24，48 h時(shí)各提取物的半抑制濃度（IC50）值。

1.2.2 CCK－8法檢測(cè)S對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

根據(jù)24 h及48 h的IC50值擬訂口蝦蛄總生物堿終質(zhì)量濃度分別為0.8，4，20，100，500 μg／mL，操作方法與1.2.1項(xiàng)下方法相同。

1.2.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)S對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，胰蛋白酶消化，吹打成單個(gè)細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，用10%胎牛血清的RPMI 1640稀釋成1×104個(gè)／mL的細(xì)胞懸液，6孔板內(nèi)每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，再加入1.9 mL 10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入2 mL 0.1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)24 h后，加入含不同質(zhì)量濃度S的10%胎牛血清的RPMI 1640（0，10，50，100 μg／mL）培養(yǎng)，隔3 d換1次含S的溶液，2周后終止培養(yǎng)，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)小心清洗3次，加入甲醇固定30 min，去固定液，加入結(jié)晶紫染色30 min，用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置，疊加1張帶網(wǎng)格的透明膠片，在顯微鏡（低倍鏡）下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，最后計(jì)算克隆形成率。克隆形成率(%)＝（克隆數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)）× 100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)S刺激細(xì)胞前后細(xì)胞周期變化

調(diào)整口蝦蛄總生物堿終質(zhì)量濃度為50 μg／mL，對(duì)HepG2細(xì)胞作用48 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞，各待檢標(biāo)本保證細(xì)胞總數(shù)不少于1×106個(gè)，離心，棄上清液，并以70%乙醇固定過夜，第2天離心，棄上清液，用PBS洗2遍后，以含碘化丙啶（PI）100 mg／L和核糖核酸酶(RNase)100 mg／L的染色液0.5 mL，在4℃下避光染色30 min，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。

2 結(jié)果

2.1 L及S對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

兩組分作用24，48 h后，HepG2細(xì)胞活性的抑制率見表1。采用Bliss算法得S作用于HepG2細(xì)胞24 h和48 h的IC50分別為（211.93±0.54）μg／mL和（23.06±0.72）μg／mL。水提取物（L）組的抑制率過低，未計(jì)算IC50。

2.2 S對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

S作用24，48，72 h后，HepG2細(xì)胞活性的抑制率見表2，顯示呈時(shí)間依賴性地降低HepG2的存活率。采用Bliss算法得S作用于HepG2細(xì)胞24，48，72 h的IC50分別為（746.72±0.68）μg／mL、（47.58±0.35）μg／mL和（26.32±0.56）μg／mL。

表1 L和S在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s，%，n＝4）

表1 L和S在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響（±s，%，n＝4）

注：不同質(zhì)量濃度、不同時(shí)間點(diǎn)之間相比，P＜0.05。

?

表2 S在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（±s，%，n＝4）

表2 S在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（±s，%，n＝4）

注：不同質(zhì)量濃度或不同時(shí)間點(diǎn)之間比較，P＜0.05。

質(zhì)量濃度（ g／mL）0.8 4.0 20.0 100.0 500.0 5－Fu（40.0）24 h抑制率2.73±0.38 5.97±0.67 6.01±0.31 18.33±0.45 58.52±0.92 39.45±0.74 48 h抑制率12.44±0.41 22.83±0.78 31.44±0.69 45.95±0.58 85.87±0.55 78.26±0.93 72 h抑制率16.35±0.72 27.91±0.98 35.47±1.11 54.73±0.98 90.32±0.85 84.78±0.37

2.3 S對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響

結(jié)果見表3。在含0，10，50，100 μg／mL S的培養(yǎng)液孵育2周后，各劑量組細(xì)胞克隆形成率依次為56.1%，35.7%，14.1%，0，表明S呈濃度依賴性抑制HepG2細(xì)胞的增殖。2.4S對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響

表3 S對(duì)HepG2細(xì)胞克隆的影響（±s）

表3 S對(duì)HepG2細(xì)胞克隆的影響（±s）

注：不同質(zhì)量濃度組比較，P＜0.05。

樣本數(shù)質(zhì)量濃度（ g／mL）0 25 50 100 3333克隆數(shù)761±52.3 357±88.5 141±28.8 0

口蝦蛄總生物堿作用48 h后，使HepG2細(xì)胞周期的S期比例由26.14%上升為40.80%，而G1期比例由64.10%下降為42.40%。詳見表4。

表4 S刺激HepG2細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期改變（±s，n＝3）

表4 S刺激HepG2細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期改變（±s，n＝3）

注：與0 g／mL質(zhì)量濃度組相比， P＜0.05。

S質(zhì)量濃度( g／mL) 0 50 G1 64.10±0.42 42.40±0.67 26.14±0.37 40.80±0.43 G2／M 9.76±0.85 16.80±0.61

3 討論

從海洋生物中提取、分離和篩選高效低毒的抗腫瘤活性物質(zhì)，是目前抗癌藥物研究開發(fā)的焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，多種海洋生物中含有多肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、Pectenotoxin－2[6]及多烯醚類等多種抗癌物質(zhì)。近年來，海洋微生物代謝產(chǎn)物如生物堿類活性物質(zhì)的研究備受關(guān)注[7]，如中國南海柳珊瑚來源的真菌可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著、可能具有抗癌活性的新萜類二氫喹啉酮生物堿[8]。海洋生物紅樹林來源微生物的生物堿類次級(jí)代謝產(chǎn)物，在抗菌、抗腫瘤、抗氧化和細(xì)胞毒性等方面有著巨大的開發(fā)應(yīng)用潛力[9]。

本課題中采取的系統(tǒng)溶劑提取法[3－5，10]是近年提取分離海洋生物抗癌活性成分的常用方法。其中，口蝦蛄乙酸乙酯提取物抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果較好，正丁醇提取物效果次之，石油醚提取物效果較差。對(duì)口蝦蛄乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物進(jìn)行進(jìn)一步分離和色譜分析鑒定，均可能含有生物堿類物質(zhì)。在口蝦蛄提取物乙酸乙酯及正丁醇提取物的分離、純化過程中發(fā)現(xiàn)，各組分含有的成分較復(fù)雜，難以進(jìn)一步開展研究。總之，近年所采取的口蝦蛄系統(tǒng)溶劑提取法，難以進(jìn)一步分離出較純的生物堿類物質(zhì)。本研究中根據(jù)口蝦蛄的生物堿類物質(zhì)具有較好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，以及乙酸乙酯提取物抑制腫瘤細(xì)胞增殖較好的研究基礎(chǔ)，采用經(jīng)典的酸提堿沉法[11]，并用乙酸乙酯直接萃取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法有利于總生物堿類物質(zhì)的高效提取，又可避免過多雜質(zhì)的提取。

口蝦蛄總生物堿具有的多種生物學(xué)活性有待開發(fā)。本研究中應(yīng)用不同質(zhì)量濃度的口蝦蛄總生物堿處理人肝癌HepG2細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖明顯受抑，作用48 h后的IC50為47.58 μg／mL，并呈現(xiàn)劑量－時(shí)間－效應(yīng)關(guān)系。此外，口蝦蛄總生物堿亦能明顯降低人肝癌HepG2細(xì)胞的克隆形成能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄總生物堿能將人肝癌HepG2細(xì)胞周期阻滯在S期，從而抑制細(xì)胞的增殖。大量研究表明，一些天然產(chǎn)物可通過細(xì)胞周期阻滯以抑制HepG2細(xì)胞的增殖。如白藜蘆醇可能通過影響CDK2及Cyclin E的活性，使HepG2細(xì)胞阻滯在S期，從而抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖[12]；哇巴因（ouabain）和華蟾毒配基（cinobufogenin）可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞周期S期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]；蛋白聚糖P1可能通過P27kip1－cyclin A／D1／E－CDK2通路使HepG2細(xì)胞阻滯在S期，從而抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖[14]；桑黃多糖P1可能通過提高細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度及下調(diào)多個(gè)基因，如CaMKⅡ，EGF，EGFR，K－ras，c－fos的表達(dá)，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞S期阻滯，從而抑制HepG2細(xì)胞增殖[15]。

綜上所述，口蝦蛄總生物堿可有效抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的活性，且可將細(xì)胞周期阻滯于S期，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但具體的凋亡機(jī)制、體內(nèi)動(dòng)物模型中的抗腫瘤效果和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Experimental Studies on the Anti－Tumor Function of the Total Alkaloids of Squilla Oratoria against the Human Hepatoma HepG2 Cell

Wang Huaigao，Kong Xia，Guo Xianghua，Gu Dishui，Li Binbin，Zhou Yanfang

（Department of Pathophysiology，Guangdong Medical University，Dongguan，Guangdong，China523808）

ObjectiveTo extract and analyze the anti－tumor function of the total alkaloids of Squilla oratoria against the human hepatoma HepG2 cell.M ethodsThe total alkaloids of Squilla oratoriawere extracted by acid extraction and alkaline deposition，then isolatedby ethyl acetate；CCK－8 assay，plate clone formation assay，flow cytometry，were performed to measure the effect of the total alkaloids ofSquilla oratoriaon the human hepatoma HepG2 cell.ResultsTheIC50of cell viability on HepG2 cells after treated with S for 24 h，48 h，and 72 h was 746.72 μg／mL，47.58 μg／mL or 26.32 μg／mL，respectively.After treated with S（0 μg／mL，10 μg／mL，50 μg／mL and 100 μg／mL）for two weeks，the cloning efficiency of HepG2 cells was 56.1%，35.7%，14.1%or 0，respectively；AftertreatedwithSfor48h，thehumanhepatomaHepG2cellsinSstagewasincreasedfrom26.14%to 40.80%.ConclusionThe total alkaloids of Squilla oratoria has an inhibitory effect on the cell growth in HepG2 cells through the Pathways of cell cycle arrest.

squilla oratoria；total alkaloids；human hepatoma HepG2 cell；cell counting kit－8 assay；plate clone formation assay；cell cycle

R965；R979.1

A

1006－4931(2017)02－0016－04

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.02.005

2016－08－10；

2016－11－06)

廣東建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研項(xiàng)目[20141155]；廣東醫(yī)學(xué)院面上基金項(xiàng)目[2xk1310]。

王槐高（1978－），男，碩士研究生，講師，研究方向?yàn)槟[瘤防治，（電話）0769－22896324（電子信箱）wanghuaigao＠gdmu.edu.cn。