王白燕，韓倩倩，朱艷琴，李 光，石佳佳

河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 鄭州 450046

GRP78、CHOP在α-細(xì)辛醚誘導(dǎo)的Eca109細(xì)胞凋亡中的作用*

王白燕，韓倩倩，朱艷琴#，李 光，石佳佳

河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 鄭州 450046

#通信作者，女，1956年11月生，碩士，教授，研究方向：中藥抗腫瘤，E-mail：jc.zyqin@163.com

α-細(xì)辛醚；Eca109細(xì)胞；增殖抑制；凋亡；GRP78；CHOP

目的：研究葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)在α-細(xì)辛醚誘導(dǎo)的人食管癌Eca109細(xì)胞凋亡中的作用。方法：采用0.25、0.50及1.00 g/L的α-細(xì)辛醚作用于體外培養(yǎng)的Eca109細(xì)胞，并以無干預(yù)的細(xì)胞作為對(duì)照。分別于培養(yǎng)后12、24、36、48 h，采用MTT法檢測Eca109細(xì)胞的增殖抑制情況；采用免疫熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡情況；運(yùn)用Real-time PCR和Western blot檢測凋亡相關(guān)基因GRP78和CHOP的表達(dá)水平。結(jié)果：α-細(xì)辛醚對(duì)Eca109細(xì)胞的增殖具有抑制作用(P<0.05)，且具有時(shí)間、劑量效應(yīng)關(guān)系。α-細(xì)辛醚作用48 h后，GRP78和CHOP mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。結(jié)論：α-細(xì)辛醚可抑制Eca109細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP表達(dá)有關(guān)。

食管癌(esophageal carcinoma，EC)是常見的上消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重影響著人們的健康和生活質(zhì)量[1]。食管癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多因素綜合作用的結(jié)果。α-細(xì)辛醚是中藥石菖蒲揮發(fā)油中的主要活性成分，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為石菖蒲有化痰開竅、鎮(zhèn)靜和抗驚厥之功效，可用于治療癲癇[2]。也有文獻(xiàn)[3]報(bào)道中藥石菖蒲揮發(fā)油中的另一主要成分β-細(xì)辛醚在誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞凋亡中起到了一定的作用，其機(jī)制可能與線粒體途徑有關(guān)。而對(duì)于α-細(xì)辛醚抗腫瘤的研究尚未見報(bào)道。作者所在的課題組[4]在前期的研究中初步發(fā)現(xiàn)，α-細(xì)辛醚可誘導(dǎo)人食管癌Eca109細(xì)胞發(fā)生凋亡，該研究進(jìn)一步對(duì)其凋亡機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 α-細(xì)辛醚注射液(批號(hào)201308，規(guī)格2 mg)；Eca109細(xì)胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染試劑盒購自北京Solarbio公司；鼠多抗GRP78購自Abcam公司；鼠多抗CHOP購自Cell Signaling公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz公司；TECAN酶聯(lián)免疫檢測儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；全波長掃描式多功能讀數(shù)儀為Thermo Fisher公司產(chǎn)品；生物分子成像儀為日本富士產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 取對(duì)數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞，制成2×104mL-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，分別用0.25、0.50、1.00 g/L α-細(xì)辛醚處理，不干預(yù)的作對(duì)照。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行藥物干預(yù)。

1.3 MTT 檢測細(xì)胞增殖抑制情況 細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 h后每孔直接加入MTT溶液20 μL，4 h后吸棄液體，加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔的吸光度(A)值，重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值 / 對(duì)照組A值)×100%。

1.4 免疫熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡情況 用胰蛋白酶消化培養(yǎng)48 h、貼壁生長的細(xì)胞。收集細(xì)胞，PBS洗滌2遍，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入50 μL PBS重懸；按AO/EB雙染試劑盒說明書染色，吸取混合液10 μL，滴于載玻片上，蓋玻片封片，在510 nm波長處激發(fā)熒光，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Real-time PCR法檢測GRP78和CHOP mRNA的表達(dá) 培養(yǎng)48 h后，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，按說明書提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系：2 × Ultra SYBR Mixture 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，無菌水7 μL,總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔和2個(gè)陰性對(duì)照，mRNA含量根據(jù)各個(gè)樣本的β-actin含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果用相對(duì)定量2-ΔΔCT法分析。

1.6 Western blot法檢測GRP78和CHOP蛋白的表達(dá) 培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞用PBS洗滌2遍，棄上清，常規(guī)冰浴裂解50 min，14 000 r/min離心5 min，取上清即為細(xì)胞總蛋白樣品，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣量為30 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳的分離膠濃度為120 g/L，蛋白分離后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件：恒流300 mA，1.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用TBST洗膜，5 min×3次。室溫下振搖封閉2 h，然后分別加鼠抗人GRP78、CHOP抗體(稀釋1 000倍)，4 ℃孵育過夜，再與HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(稀釋1 000倍)結(jié)合，TBST漂洗。化學(xué)發(fā)光法顯色照相。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行分析，各組細(xì)胞增殖抑制情況的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，GRP78和CHOP mRNA以及蛋白表達(dá)情況的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組Eca109細(xì)胞增殖抑制情況 見表2。

表2 各組Eca109細(xì)胞增殖抑制情況(n=6)

F組間=66.891，F(xiàn)時(shí)間=297.823，F(xiàn)交互=16.624，P均﹤0.001。

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況 α-細(xì)辛醚作用于Eca109 細(xì)胞48 h后，即發(fā)生明顯的細(xì)胞形態(tài)變化。AO/EB雙染后倒置顯微鏡下可見對(duì)照組細(xì)胞處于存活狀態(tài)(綠色熒光)，未見凋亡細(xì)胞；α-細(xì)辛醚處理組細(xì)胞的部分細(xì)胞核呈現(xiàn)出早期(橘紅色熒光)或晚期(紅色熒光)凋亡狀態(tài)(圖1)。

A：對(duì)照組；B：0.25 g/L α-細(xì)辛醚處理組；C：0.50 g/L α-細(xì)辛醚處理組；D：1.00 g/L α-細(xì)辛醚處理組。圖1 各組Eca109 細(xì)胞AO/EB雙染觀察結(jié)果(×400)

2.3 各組GRP78和CHOP mRNA的表達(dá)情況 見表3。

表3 各組GRP78和CHOP mRNA的表達(dá)情況 (n=3)

*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與0.25 g/L α-細(xì)辛醚處理組相比，P<0.05；△：與0.50 g/L α-細(xì)辛醚處理組相比，P<0.05。

2.4 各組GRP78和CHOP 蛋白的表達(dá)情況 見圖2和表4。

1：對(duì)照組；2：0.25 g/L α-細(xì)辛醚處理組；3：0.50 g/L α-細(xì)辛醚處理組；4：1.00 g/L α-細(xì)辛醚處理組。圖2 各組GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)

表4 各組GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)情況(n=3)

*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與0.25 g/L α-細(xì)辛醚處理組相比，P<0.05；△：與0.50 g/L α-細(xì)辛醚處理組相比，P<0.05。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參與蛋白質(zhì)合成、修飾與加工的重要細(xì)胞器，是調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的場所。當(dāng)細(xì)胞受到低氧等有害刺激時(shí)，可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊蛋白的能力被削弱，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積聚，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，繼而導(dǎo)致促凋亡編碼基因的激活[5-6]。ERS可通過線粒體Apaf.1依賴途徑、Caspase-12活化途徑、Bcl-2家族、Ca2+、CHOP等多條信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。其中 CHOP 是介導(dǎo)ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可抑制Bcl-2的啟動(dòng)，其在正常的細(xì)胞中低表達(dá)，而在ERS時(shí)激活并伴 mRNA 及蛋白水平表達(dá)升高，通過活化胱天蛋白酶 9 前體、啟動(dòng)胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-9]。

GRP78也稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白 BIP，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的一種分子伴侶，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，是促進(jìn)蛋白質(zhì)正常合成和成熟、維持細(xì)胞正常生理功能的一種重要分子[10]。GRP78也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種應(yīng)激蛋白，在細(xì)胞受刺激時(shí)高表達(dá)從而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用[11]。有研究[12]表明，GRP78 在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平比在正常細(xì)胞中高，推測GRP78在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起到一定的調(diào)控作用。

該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度α-細(xì)辛醚處理可抑制Eca109細(xì)胞增殖，促進(jìn)Eca109細(xì)胞凋亡，Real-time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)α-細(xì)辛醚處理組細(xì)胞GRP78與CHOP mRNA和蛋白高表達(dá)，提示藥物處理后細(xì)胞發(fā)生了ERS，繼而通過ERS下游靶基因CHOP信號(hào)通路使CHOP mRNA 高表達(dá)，從而誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡。但CHOP誘導(dǎo)凋亡的下游信號(hào)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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[2]劉秋弟,劉夕霞,吳原,等.α-細(xì)辛醚對(duì)KA癲癇大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2的影響[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2013,30(4):312

[3]吳堅(jiān),張星星,陳敏,等.β-細(xì)辛醚對(duì)腸癌細(xì)胞 HT-29生物行為學(xué)的影響及機(jī)制[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2014,25(5):1103

[4]王甜甜,吳芳,朱艷琴,等.α-細(xì)辛醚誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞系Eca-109凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào),2014,29(4):473

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(2016-08-26收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Effects of GRP78 and CHOP on apoptosis of human esophageal carcinoma Eca109 cells induced by α-asarone

WANGBaiyan,HANQianqian,ZHUYanqin,LIGuang,SHIJiajia

ExperimentTeachingCenter,BasicMedicalSchool,HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046

α-asarone；Eca109 cell line；proliferation inhibition；apoptosis；GRP78；CHOP

Aim: To investigate the effect of GRP78 and CHOP on apoptosis of human esophageal carcinoma Eca109 cell line induced by α-asarone. Methods: Eca109 cells were cultured for 24 h, and were treated with various concentrations(0.25, 0.50 and 1.00 g/L) of α-asarone for 12, 24, 36 and 48 h, respectively. MTT assay was used to detect the proliferation of Eca109 cells. The apoptosis morphological changes of Eca109 cells were observed with an inverted microscope. The expression level of GRP78 and CHOP were measured by Real-time PCR and Western blot, respectively.Results: α-asarone had obvious time- and dose-dependent inhibition effects on the proliferation of Eca109 cells(P<0.05). After Eca109 cells were treated with various concentrations of α-asarone for 48 h，the expressions of both GRP78 and CHOP were increased significantly(P<0.05). Conclusion: α-asarone could inhibit the proliferation of Eca109 cells and induce cell apoptosis by regulating the expressions of GRP78 and CHOP.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.001

*鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目 131PPTGG417-1；鄭州市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 121PCXTD520

R735.1