史海霞, 楊嘉君, 聶緒強(qiáng)，薛永亮，卞 卡

1)上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院北院中醫(yī)科 上海 201900 2)上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心 上海 201023 3)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 上海 200233 4)遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 貴州遵義 563000 5)河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 河南開封 475001 6)喬治·華盛頓大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 美國(guó) 華盛頓 20037

赤芍醇提物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成和分泌的影響*

史海霞1,2)#, 楊嘉君3)#, 聶緒強(qiáng)2,4)，薛永亮2,5)，卞 卡2,6)

1)上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院北院中醫(yī)科 上海 201900 2)上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心 上海 201023 3)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 上海 200233 4)遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 貴州遵義 563000 5)河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 河南開封 475001 6)喬治·華盛頓大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 美國(guó) 華盛頓 20037

#通信作者：史海霞, 女，1973年1月生，博士，主治醫(yī)師，研究方向：心腦血管疾病的中醫(yī)藥防治，E-mail:haixia.0101@163.com；楊嘉君，女，1968年7月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心腦血管疾病的治療，E-mail:yangjiajunfzy@sina.com

赤芍;蛋白激酶B;內(nèi)皮型一氧化氮合酶;一氧化氮;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

目的：觀察赤芍95%乙醇提取物(PVL)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中一氧化氮(NO)合成和分泌的影響。方法：分別用0.025、0.050、0.100 g/L PVL孵育HUVECs，利用熒光染料DAF-FM DA及硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)、外NO含量，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和乙酰膽堿陽(yáng)性對(duì)照組。用0.100 g/L的PVL孵育HUVECs 0、2、5、10、15、30、60、120 min,采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Akt、eNOS總蛋白及Akt Ser473、eNOS Ser1177和eNOS Thr495磷酸化蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：PVL可劑量依賴性地提高HUVECs細(xì)胞內(nèi)、外NO含量(P<0.05)。0.100 g/L的PVL作用120 min內(nèi)，eNOS Ser1177、Akt Ser473的磷酸化及eNOS Thr495的脫磷酸化水平均隨時(shí)間改變有不同程度的變化(P<0.05)。結(jié)論：PVL可能通過激活A(yù)kt-eNOS-NO信號(hào)通路而增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞NO的合成和分泌，從而發(fā)揮其內(nèi)皮依賴性舒張血管的作用。

赤芍為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)或川赤芍(PaeoniaveitchiiLynch)的干燥根。赤芍屬于傳統(tǒng)活血化瘀藥，味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血，散瘀止痛的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有抗凝、抗血栓[1]、抗血小板聚集[2]、抑制平滑肌細(xì)胞增生[3]、預(yù)防血管重塑[4]、保護(hù)血管內(nèi)膜功能[5]等作用。前期的研究結(jié)果[6]表明，赤芍的乙醇提取物具有內(nèi)皮依賴性舒張血管功能，其作用機(jī)制與一氧化氮(nitric oxide, NO)有關(guān)。該研究在前期研究基礎(chǔ)上，觀察了赤芍95%乙醇提取物(簡(jiǎn)稱PVL)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelium cells, HUVECs)NO、蛋白激酶B(protein kinase B, PKB或Akt)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)表達(dá)的影響，探討其內(nèi)皮依賴性舒張血管作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 HEPA CLASS 100型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和全波長(zhǎng)多功能微孔板讀數(shù)儀(美國(guó)Thermo公司)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，SpectraMax 190酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)，Centrifuge 5810R低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)Biorad公司)。PVL由上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心提供。A013型硝酸還原酶法NO檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，鼠抗eNOS單克隆抗體、抗磷酸化eNOS(p-eNOS) Ser1177單克隆抗體(美國(guó)BD公司)，兔抗p-eNOS Thr495、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)Ser473單克隆抗體(美國(guó)CST公司)。

1.2 細(xì)胞來源 HUVECs(CRL-1730，美國(guó)ATCC公司) 用含體積分?jǐn)?shù)10% 新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d傳代1次，取4～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 PVL對(duì)HUVECs培養(yǎng)上清液中NO含量的影響 將HUVECs接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分5組(乙酰膽堿組，空白對(duì)照組及PVL低、中、高劑量組)，每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每孔加入左旋-精氨酸(L-Arg)預(yù)孵育30 min后，PVL低、中、高劑量組分別加入0.025、0.050、0.100 g/L的PVL 37 ℃孵育24 h，乙酰膽堿組加入1×10-5mol/L的乙酰膽堿；收集上清液，采用NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NO含量。

1.4 PVL對(duì)HUVECs胞內(nèi)NO含量的影響 HUVECs 以50 000個(gè)/孔接種于96孔板，加入L-Arg和熒光染料DAF-FM DA預(yù)孵育30 min后，洗去細(xì)胞外殘余染料，按1.3實(shí)驗(yàn)分組，加入相應(yīng)試劑37 ℃避光孵育20 min后，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值，用以表示NO含量，激發(fā)波長(zhǎng)為495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm。

1.5 PVL對(duì)HUVECs中p-eNOS Ser1177、p-eNOS Thr495和p-Akt Ser473蛋白表達(dá)的影響 HUVECs按1×106個(gè)/皿接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng)，更換無血清DMEM培養(yǎng)基過夜；更換含PVL(0.100 g/L)的無血清DMEM培養(yǎng)基，37 ℃孵育0、2、5、10、15、30、60、120 min。離心提取蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，蛋白質(zhì)樣品分裝凍存于-80 ℃冰箱。采用SDS-PAGE分離蛋白，每孔上樣量20～30 μL，經(jīng)120 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，將所需條帶轉(zhuǎn)運(yùn)至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，二抗室溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，隨后化學(xué)發(fā)光法顯色，經(jīng)暗室曝光，膠片經(jīng)掃描儀掃描后用凝膠分析軟件Quantity One分析，計(jì)算各條帶OD值。以0 min的數(shù)據(jù)為1，標(biāo)化其他時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)。磷酸化蛋白的表達(dá)水平以磷酸化蛋白OD/總蛋白OD表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?？贵w名稱及稀釋度見表1。

表1 抗體及稀釋度

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 6.0軟件分析。組間各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PVL對(duì)HUVECs細(xì)胞內(nèi)、外NO含量的影響

不同濃度PVL培養(yǎng)后HUVECs細(xì)胞內(nèi)、外NO含量測(cè)定結(jié)果見表2，從表2可以看出，PVL可以使HUVECs細(xì)胞內(nèi)、外NO含量上升，其作用呈劑量依賴性。

表2 不同質(zhì)量濃度PVL作用后HUVECs細(xì)胞內(nèi)、外NO的含量

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05;#:與PVL低劑量組比較，P<0.05;△：與PVL中劑量組比較，P<0.05。

2.2 PVL對(duì)HUVECs中eNOS及Akt磷酸化的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖1、表3。結(jié)果顯示，PVL處理HUVECs 120 min對(duì)eNOS總蛋白和Akt無影響；但是可以促進(jìn)eNOS Ser1177和Akt Ser473的磷酸化，10 min后達(dá)峰值，之后兩者磷酸化水平逐漸降低；而15 min 后eNOS Thr495磷酸化水平顯著降低，隨后緩慢恢復(fù)。

1～8：分別為0、2、5、10、15、30、60、120 min。圖1 PVL作用后HUVECs中eNOS和Akt磷酸化蛋白的表達(dá)

表3 PVL作用不同時(shí)間后HUVECs中eNOS、Akt磷酸化蛋白的表達(dá)水平

*：與其他時(shí)間點(diǎn)比較，P<0.05。

3 討論

內(nèi)皮源性NO是一種重要的內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)因子，在血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其調(diào)節(jié)作用主要是通過調(diào)節(jié)血管張力和血壓、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、抑制血小板聚集、抑制單核細(xì)胞和血小板的黏附等來實(shí)現(xiàn)的[7]。eNOS存在于內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血小板以及肥大細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，是體內(nèi)NO合成的關(guān)鍵酶[8]。eNOS是由兩個(gè)相同的亞基組成的同源二聚體酶，二聚體化是其完全活化的前提[9-10]。eNOS在內(nèi)皮細(xì)胞中呈構(gòu)成性表達(dá)，因此，對(duì)eNOS活性調(diào)控的研究多集中于翻譯后蛋白水平的調(diào)控，也就是翻譯后修飾，包括?；?、鈣/鈣調(diào)素結(jié)合、S-亞硝基化和磷酸化等，其中由蛋白激酶和磷蛋白磷酸酶介導(dǎo)的磷酸化和去磷酸化網(wǎng)絡(luò)是主要的翻譯后修飾[11-12]。目前研究[13-14]表明，eNOS的磷酸化可以發(fā)生于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點(diǎn)，Ser1177、Ser635、Ser617和Tyr83磷酸化可上調(diào)eNOS活性， Ser116、Thr495和Tyr653磷酸化則下調(diào)eNOS活性。最經(jīng)典的功能性磷酸化序列是位于還原酶區(qū)的絲氨酸位點(diǎn)(人的eNOS Ser1177)和位于鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)的蘇氨酸位點(diǎn)(人的eNOS Thr495)[11]。許多激酶可以介導(dǎo)eNOS Ser1177的磷酸化從而激活eNOS，如PKB/Akt、蛋白激酶A、AMP激活的蛋白激酶、蛋白激酶G和鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶-2等[15-18]，其中以PI3K/Akt通路最為關(guān)鍵[19-21]。

赤芍出自《開寶本草》，屬于傳統(tǒng)活血化瘀藥，其乙醇提取物具有內(nèi)皮依賴性舒張血管的功能[6]。該實(shí)驗(yàn)觀察了PVL對(duì)HUVECs細(xì)胞內(nèi)、外NO含量的影響。NO是一種活性很強(qiáng)的自由基小分子，化學(xué)性質(zhì)活潑，半衰期僅3～5 s，在體內(nèi)很快代謝為NO2ˉ和NO3ˉ，該實(shí)驗(yàn)所采用的NO檢測(cè)試劑盒就是通過測(cè)定其代謝生成的亞硝酸鹽及硝酸鹽含量來間接檢測(cè)NO水平，這也是目前普遍采用的NO檢測(cè)方法,其原理是基于化學(xué)顯色反應(yīng)：利用硝酸還原酶特異性將NO3ˉ還原為NO2ˉ，NO2ˉ遇硝酸鹽顯色劑可生成淡紅色偶氮化合物，通過比色可間接測(cè)得NO濃度。由于采用比色法檢測(cè)，考慮到PVL的顏色有可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生干擾，故在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了不加細(xì)胞的陰性對(duì)照，將實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)減去陰性對(duì)照數(shù)據(jù)作為最終測(cè)定結(jié)果，以排除PVL的顏色干擾。結(jié)果顯示，在0.025～0.100 g/L的濃度范圍內(nèi)，PVL能劑量依賴性地促進(jìn)HUVECs合成和分泌NO。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PVL處理120 min內(nèi)對(duì)HUVECs中eNOS總蛋白表達(dá)無影響，但是可以促進(jìn)eNOS Ser1177的磷酸化，磷酸化水平在作用10 min后達(dá)峰值，其后逐漸恢復(fù)；而eNOS Thr495發(fā)生脫磷酸化，磷酸化水平在作用15 min后達(dá)最低，其后緩慢恢復(fù)。與此同時(shí)，作者還觀察到，PVL還可以上調(diào)Akt磷酸化蛋白的表達(dá)，Akt磷酸化水平在作用10 min后達(dá)峰值，其后逐漸降低，時(shí)間曲線與eNOS Ser1177相似，提示Akt信號(hào)通路參與了PVL對(duì)eNOS Ser1177磷酸化的誘導(dǎo)，PVL內(nèi)皮依賴性舒張血管作用的機(jī)制與eNOS Ser1177磷酸化介導(dǎo)的eNOS活性上調(diào)、NO生成增加有關(guān)。

綜上所述，該研究證實(shí)PVL內(nèi)皮依賴性舒張血管的作用機(jī)制至少部分是通過Akt-eNOS-NO信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，這為臨床廣泛應(yīng)用赤芍改善心腦血管疾病相關(guān)癥狀提供了理論支持，至于是單體成分的作用或是幾種成分的協(xié)同作用尚有待進(jìn)一步深入研究。

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(2016-12-26收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of ethanol extract ofPaeoniaveitchiiLynch on production and secretion of nitric oxide in HUVECs

SHIHaixia1,2),YANGJiajun3),NIEXuqiang2,4),XUEYongliang2,5),BIANKa2,6)

1)DepartmentofTraditionalChineseMedicine,NO.9People'sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201900 2)MuradResearchCenterforModernizedChineseMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201023 3)DepartmentofNeurology,NO.6People'sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200233 4)SchoolofPharmacy,ZunyiMedicalUniversity,Zunyi,Guizhou563000 5)DepartmentofCardiovascular,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversity,Kaifeng,Henan475001 5)DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GeorgeWashingtonUniversity,WashingtonDC,USA20037

PaeoniaveitchiiLynch;protein kinase B;endothelial nitric oxide synthase;nitric oxide;human umbilical venus endothelial cell

Aim: To investigate the effect of 95% ethanol extract ofPaeoniaveitchiiLynch(PVL) on production and secretion of nitric oxide(NO) in cultured human umbilical vein endothelium cells(HUVECs). Methods: The HUVECs were incubated in different concentration(0.025, 0.050, 0.100 g/L) PVLinvitro, respectively. The content of NO inside and outside HUVECs were measured by DAF-FM DA and Griess reaction. The expression levels of Akt, eNOS, p-Akt Ser473, p-eNOS Ser1177and p-eNOS Thr495in HUVECs cultured with 0.100 g/L PVL for 0,2,5,10,15,30,60,120 min were assessed by Western blot. Results: PVL increased the extracellular and intracellular NO production in a dose-dependent manner in cultured HUVECs(P<0.05). PVL also changed the phosphorylation of Akt Ser473, eNOS Ser1177and dephosphorylation of eNOS Thr495in HUVECs at different time points(P<0.05). Conclusion: PVL could increase the NO production in HUVECs, thus play a role of endothelium dependent vasodilation, and the mechanism may be related to the activation of Akt-eNOS-NO signal transduction pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.013

*上海市科委生物醫(yī)藥重點(diǎn)項(xiàng)目子課題 14401970303；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院科研項(xiàng)目 syz2011-02；上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院預(yù)研基金 LYZY-0175

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