杜燕華，李 懿，程寧寧，許汴利，黃學(xué)勇#

1)河南省疾病預(yù)防控制中心河南省醫(yī)學(xué)病原生物學(xué)重點實驗室 鄭州 450016 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001

新布尼亞病毒IgG抗體間接ELISA檢測方法的建立*

杜燕華1)，李 懿1)，程寧寧2)，許汴利1)，黃學(xué)勇1)#

1)河南省疾病預(yù)防控制中心河南省醫(yī)學(xué)病原生物學(xué)重點實驗室 鄭州 450016 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001

#通信作者，男，1969年10月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：分子流行病學(xué)，E-mail:huangxy@hncdc.com.cn

新布尼亞病毒；發(fā)熱伴血小板減少綜合征；間接ELISA法

目的：建立基于間接ELISA法檢測新布尼亞病毒IgG抗體的血清學(xué)檢測方法。方法：應(yīng)用基因工程原核表達的新布尼亞病毒核蛋白，初步建立用于新布尼亞病毒IgG抗體檢測的間接ELISA法，用該方法對267例發(fā)熱伴血小板減少綜合征患者急性期和恢復(fù)期雙份血清和198份標本進行檢測，并與間接免疫熒光法的結(jié)果進行對比。結(jié)果：所建立的新布尼亞病毒IgG抗體間接ELISA檢測方法重復(fù)性好，與其他病毒無交叉反應(yīng)。與間接免疫法對267例發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例的實驗室診斷結(jié)果有較好的一致性(Kappa=0.69),健康人血清檢測陽性率為5.56%。結(jié)論：建立的間接ELISA方法適用于新布尼亞病毒感染的實驗室診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

新布尼亞病毒是新發(fā)傳染病——發(fā)熱伴血小板減少綜合征的主要病原體，2010年在我國首次發(fā)現(xiàn)[1-2]。2011至2014年全國23個省份共報告發(fā)熱伴血小板減少綜合征5 352例，河南省報告2 143例，是目前發(fā)病最多的省份，也是最早監(jiān)測該疾病的省份[3]。隨著病例發(fā)現(xiàn)能力的增加，病例報告人數(shù)和檢測人數(shù)也逐年增加，2015年河南本地報告發(fā)熱伴血小板減少綜合征1 053例，創(chuàng)歷年新高。目前實驗室診斷主要用新布尼亞病毒的熒光定量PCR方法檢測，該方法對儀器設(shè)備、實驗條件和人員操作的要求都比較高，檢測試劑成本也比較高。作者建立了一種基于間接ELISA法檢測新布尼亞病毒IgG抗體的血清學(xué)檢測方法，可用于監(jiān)測病例的實驗室診斷和健康人的血清流行病學(xué)調(diào)查，報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集267份2012至2015年信陽市發(fā)熱伴血小板減少綜合征實驗室確診病例的血清標本，確診方法為新布尼亞病毒急性期血清熒光定量PCR檢測或IgM檢測陽性。每例病例均采集急性期(發(fā)病2周內(nèi))和恢復(fù)期(發(fā)病4周以上)非抗凝血各5 mL，共534份血清標本，保存于河南省疾病預(yù)防控制中心實驗室-70 ℃冰箱。收集同期信陽市平橋區(qū)健康體檢者血清198份。出血熱病毒、乙腦病毒、登革熱病毒IgG抗體陽性的血清各10份，由河南省疾病預(yù)防控制中心實驗室進行實驗室確診并保存。

1.2 間接ELISA檢測方法的建立與評價

1.2.1 方法的建立 PCR擴增新布尼亞病毒核蛋白(NP)基因，連接至原核表達載體pMALc2x中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109，IPTG誘導(dǎo)表達、純化，獲得MAB-NP融合蛋白，經(jīng)純化和鑒定后的NP抗原由本實驗室制備和保存[4]。用NP抗原包被微孔板4 ℃過夜，洗板，加入稀釋的血清標本，37 ℃溫箱孵育1 h，洗板，加入HRP標記的羊抗人IgG(美國 Qualex公司) 37 ℃溫箱孵育1 h，洗板，加入ABTS (美國KPL公司) 37 ℃顯色30 min，用酶標儀測定波長405 nm處的OD值。結(jié)果判定：臨界值=陰性對照平均OD值×2.1，≥臨界值的樣品判為陽性，反之為陰性。

1.2.2 工作條件的優(yōu)化 按正交表L16(43)設(shè)計安排進行正交實驗，確定最佳反應(yīng)條件，考察的因素有NP抗原包被稀釋度(A)、HRP標記的抗人IgG抗體稀釋度(B)、樣品血清稀釋度(C)，每個因素分別有4個水平，詳見表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.3 特異性 將出血熱病毒、乙腦病毒、登革熱病毒IgG抗體陽性血清各10份，用所建立的間接ELISA檢測方法進行交叉實驗，確定該方法的特異性。

1.2.4 可重復(fù)性 選擇2012年信陽市發(fā)熱伴血小板減少綜合征確診病例血清標本30份，經(jīng)二次檢測，每次同一樣本設(shè)3個復(fù)孔，確定檢測符合率并計算變異系數(shù)。

1.3 應(yīng)用效果 將267例病例的急性期和恢復(fù)期雙份血清標本分別用間接ELISA法與間接免疫熒光(IFA)法檢測，新布尼亞病毒IgG抗體陽轉(zhuǎn)或恢復(fù)期滴度較急性期4倍以上增高為陽性。IFA操作方法詳見參考文獻[5]。用所建立的間接ELISA法檢測健康體檢者血清標本198份，計算陽性率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SAS 9.1進行數(shù)據(jù)分析，對間接ELISA法與IFA檢測結(jié)果進行Kappa一致性檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 間接ELISA法工作條件的確定 正交實驗結(jié)果(表2)顯示，最佳條件是A2B3C3，即新布尼亞病毒NP抗原包被稀釋度為12 000(濃度50 μg/孔)，HRP標記的抗人IgG抗體稀釋度為130 000，樣品血清稀釋度1400。通過方差分析(表3)可知，B因素對該方法的影響較大。

表2 正交實驗結(jié)果(n=4)

表3 正交實驗方差分析

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 特異性 用所建立的間接ELISA檢測方法檢測出血熱病毒、乙腦病毒、登革熱病毒IgG抗體陽性血清，結(jié)果均為陰性，無交叉反應(yīng)。

2.2.2 可重復(fù)性 30份確診病例血清標本經(jīng)重復(fù)檢測，診斷符合率為100%，變異系數(shù)約為6%。

2.3 間接ELISA法臨床應(yīng)用效果 用兩種檢測法檢測267份血樣的結(jié)果(表4)一致性較好(Kappa=0.69，95%CI=0.58～0.79)。健康體檢者血清標本198份經(jīng)間接ELISA法檢測，新布尼亞病毒IgG抗體陽性11份，陽性率5.56%。

表4 間接ELISA法與IFA檢測結(jié)果的比較

3 討論

新布尼亞病毒NP蛋白在病毒顆粒內(nèi)通過與病毒基因組RNA和RNA聚合酶結(jié)合形成核蛋白體，在病毒顆粒內(nèi)豐度很高[6]。SARS、Nipah等很多病毒的血清學(xué)診斷方法都選擇NP蛋白作為診斷分子，且NP蛋白在整個布尼亞病毒科內(nèi)具有較強的序列保守性和穩(wěn)定性，同時又具有種的序列特異性[7]。對流行于非洲、與新布尼亞病毒同屬于白蛉病毒屬的裂谷熱病毒(rift valley fever virus,RVFV)的研究[8]表明，RVFV的NP蛋白分子比構(gòu)成病毒顆粒的其他分子(如Gn、Gc和病毒基因組RNA)能更早地被宿主細胞釋放，因此也就更容易被檢測出來?；谏鲜隹紤]，作者選取新布尼亞病毒NP蛋白作為診斷分子，建立了一種間接ELISA方法，通過與已知出血熱病毒、乙腦病毒、登革熱病毒的特異性實驗檢驗，該方法無交叉反應(yīng)且重復(fù)性好，適用于病例標本的實驗室檢測。

2010年9月原衛(wèi)生部印發(fā)《發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南(2010版)》，初步認定一種新型布尼亞病毒，暫以發(fā)熱伴血小板減少綜合征命名此病毒感染所致疾病，要求各地參照乙類傳染病的要求報告病例，并明確了確診病例的診斷標準：病例標本新型布尼亞病毒核酸檢測陽性，病例標本新型布尼亞病毒IgG抗體陽轉(zhuǎn)或恢復(fù)期滴度較急性期4倍以上增高者，病例標本分離到新型布尼亞病毒。疑似病例具備以上三項之一者即為確診病例。3種實驗室確診方法中，病毒分離雖然是一種最可靠的診斷方法，但耗時長，操作復(fù)雜，生物安全要求高，不能滿足臨床診斷的需要。核酸檢測方法雖然適合于病例的快速診斷，但對病例標本采集時限有要求，只有在病毒血癥期采集的標本才能保證診斷的準確性。而病毒抗體存在的時間較長，雖然抗體檢測方法對于發(fā)病早期的病例敏感性不如核酸檢測方法，但對于采樣距發(fā)病時間較長的病例或是隱性感染病例，血清學(xué)診斷方法有重要意義。IFA和ELISA法均可用于新布尼亞病毒IgG抗體的檢測。該研究將發(fā)熱伴血小板減少綜合征確診病例血清用兩種方法同時檢測，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，有較好的一致性。在實際工作中，IFA需要培養(yǎng)病毒，生物安全要求高，操作相對復(fù)雜，熒光值判別有一定的主觀因素，而該研究所建立的間接ELISA法容易商品化和標準化，操作簡便，對實驗儀器要求不高，因而特別適合基層大批標本的實驗室診斷和人群血清流行病學(xué)調(diào)查。

[1]許汴利.新布尼亞病毒感染致發(fā)熱伴血小板減少綜合征的發(fā)現(xiàn)、認識與啟示[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2012,46(2):99

[2]XU B,LIU L,HUANG X,et al.Metagenomic analysis of fever, thrombocytopenia and leukopenia syndrome (FTLS) in Henan Province, China: discovery of a new bunyavirus[J].PLoS Pathog,2011,7(11):e1002369

[3]李昱,周航,牟笛,等.中國2011-2014年發(fā)熱伴血小板減少綜合征流行特征分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2015,36(6):598

[4]胡小寧,黃學(xué)勇,杜燕華,等.發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒核蛋白的原核表達與鑒定[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2014,49(5):636

[5]黃學(xué)勇,杜燕華,李幸樂,等.新布尼亞病毒IgG間接免疫熒光檢測方法的建立[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2012,46(2):165

[6]LE MAY N,GAULIARD N,BILLECOCQ A,et al.The N terminus of Rift Valley fever virus nucleoprotein is essential for dimerization[J].J Virol,2005,79(18):11974

[7]SWANEPOEL R,STRUTHERS K,ERASMUS J,et al.Comparison of techniques for demonstrating antibodies to Rift Valley fever virus[J].J Hyg(Lond),1986,97(2):317

[8]LIU L,CELMA CC,ROY P.Rift Valley fever virus structural proteins: expression, characterization and assembly of recombinant proteins[J].Virol J,2008,5(1):1

(2016-07-15收稿 責任編輯王 曼)

Establishment and application of indirect ELISA of IgG antibody against new bunyavirus

DUYanhua1),LIYi1)，CHENGNingning2)，XUBianli1)，HUANGXueyong1)

1)HenanKeyLaboratoryofPathogenicMicroorganisms,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016 2)DepartmentofEpidemiology，CollegeofPublicHealth，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

new bunyavirus;fever thrombocytopenia and leukopenia syndrome;indirect ELISA

Aim: To establish an indirect ELISA method for detecting IgG antibody against new bunyavirus. Methods: Based on nucleoprotein gene of new bunyavirus obtained by prokaryotic expression, a qualitative indirect ELISA method for detecting IgG antibody was set up. Using the established method，serum samples from both acute and recovery phases of 267 patients with fever thrombocytopenia and leukopenia syndrome and 198 healthy persons were tested．The results were compared with IFA．Results: The established indirect ELISA method had better repeatability, no cross reaction with other virus. There was no significant difference in results between IFA and indirect ELISA in 267 patients with fever thrombocytopenia and leukopenia syndrome(Kappa=0.69),and the positive rate in the healthy was 5.56%. Conclusion: The indirect ELISA method for detecting IgG antibody against new bunyavirus has been established successfully, which is suitable for laboratory diagnosis and epidemiological investigation for fever thrombocytopenia and leukopenia syndrome.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.005

*國家自然科學(xué)基金項目 81573204；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目 201303194

R373.23