任志文，趙 冬，劉 祺，王 洋，許 健，王業(yè)忠#，張永超

1)新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科 新疆石河子 832008 2)山東省立醫(yī)院神經外科 濟南 250021

下調miR-210的表達對U87細胞增殖、侵襲及凋亡的影響*

任志文1)，趙 冬1)，劉 祺1)，王 洋1)，許 健1)，王業(yè)忠1)#，張永超2)

1)新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科 新疆石河子 832008 2)山東省立醫(yī)院神經外科 濟南 250021

#通信作者，男，1967年8月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：顱內腫瘤和腦血管疾病，E-mail：3081217747@qq.com

miR-210；膠質瘤；細胞增殖；細胞侵襲力

目的：探討miR-210在膠質瘤組織中的表達及下調miR-210對U87細胞增殖、侵襲及凋亡的影響。方法：選取64例擇期行手術治療的膠質瘤患者的膠質瘤組織和30例因腦外傷行內減壓術患者的正常腦組織。培養(yǎng)人腦膠質瘤U87細胞，根據轉染物不同將細胞分為反義miR-210組、陰性對照組和空白對照組，利用實時熒光定量PCR技術檢測不同腦組織及細胞中miR-210及HIF-1α基因表達，MTT比色法檢測細胞增殖情況，Transwell法檢測細胞遷移及侵襲能力，利用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，Western blot法檢測細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表達。結果：膠質瘤組織中miR-210和HIF-1α mRNA的表達均高于正常腦組織(P<0.05)；膠質瘤組織中miR-210和HIF-1α mRNA相對表達量均與腫瘤直徑和病理分級有關(P<0.05)；反義miR-210組細胞中miR-210和HIF-1α mRNA的表達均低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)。與陰性對照組和空白對照組相比，反義miR-210組細胞在48、72和96 h時光密度值降低，遷移細胞數和侵襲細胞數減少，細胞凋亡率升高(P<0.05)。反義miR-210組細胞中Bcl-2蛋白相對表達量低于陰性對照組和空白對照組，而Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白相對表達量則升高(P<0.05)。結論：miR-210在膠質瘤組織中呈高表達，下調miR-210表達可抑制細胞增殖、遷移及侵襲能力，促進細胞凋亡發(fā)生。

膠質瘤作為顱內高發(fā)的惡性腫瘤，占顱內腫瘤的35%～60%，具有發(fā)病率高、復發(fā)率高、病死率高等特點，患者預后往往較差[1]。目前，其發(fā)生、進展及復發(fā)的機制尚未研究清楚。微小RNA(micro RNA，miRNA)作為廣泛存在于機體內的高度保守的短小RNA，在多種生理、病理功能中發(fā)揮重要作用，它參與了膠質瘤發(fā)生及進展過程，且與患者預后密切相關[2]。作為miRNA的重要類型，有研究[3]認為，miR-210在缺氧環(huán)境下促進腫瘤發(fā)生及進展。亦有研究[4]指出，下調miR-210可抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡發(fā)生，增強缺氧環(huán)境中肝癌細胞對放射的敏感性。該研究對膠質瘤組織中miR-210的表達進行分析，并利用反義技術下調miR-210的表達，觀察其對膠質瘤U87細胞增殖、侵襲及凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年3月至2015年4月在新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科擇期行手術治療的膠質瘤患者64例，男35例，女29例，年齡36～73(53.7±8.6)歲，所有患者均經術后病理確診，術前均未行放化療。根據2007年WHO關于膠質瘤組織病理學和臨床標準：低級別(Ⅰ、Ⅱ期)21例，高級別(Ⅲ、Ⅳ期)43例。同期，留取因腦外傷行內減壓術患者的正常腦組織30例作為對照，男17例，女13例，年齡(54.2±9.1)歲。兩組患者性別、年齡等一般情況無差異，均衡可比。該研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 細胞來源、主要試劑及儀器 人腦膠質瘤細胞株U87購自上海奧陸生物公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，脂質體轉染試劑盒Lipfectamine 2000、Trizol總RNA提取試劑盒均購自美國 Invitrogen公司，反轉錄試劑盒和PCR試劑盒均購自大連寶生物公司，miR-210、miR-210反義序列、陰性對照序列及內參、缺氧誘導因子1α(HIF-1α)及內參引物均由上海生工生物工程有限公司設計合成，四甲基偶氮唑藍(MTT)、碘化丙啶(PI)和二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物公司，Transwell小室購自美國Corning公司，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、鼠抗人Bax單克隆抗體和HRP標記二抗均購自上海酶聯生物研究所，鼠抗人Caspase-3單克隆抗體、鼠抗人Caspase-8單克隆抗體和鼠抗人Caspase-9單克隆抗體均購自美國Abcam公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，FACSAria流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及處理 將人腦膠質瘤細胞株U87置于含胎牛血清和谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基上，于體積分數50%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行無菌培養(yǎng)。待細胞貼壁生長，取對數生長期細胞，利用脂質體轉染試劑盒Lipfectamine 2000進行轉染處理。將細胞分為3組，反義miR-210組：轉染miR-210反義序列(5’-TCAGCCGCTGTCACACGCACAG-3’)；陰性對照組：轉染陰性序列(5’-TTCTC CGAACGTGTCACGTTTC-3’)；空白對照組：不處理。各組細胞轉染后繼續(xù)進行恒溫培養(yǎng)。

1.4 利用實時熒光定量PCR技術檢測組織和各細胞中miR-210及HIF-1α mRNA的表達 取膠質瘤及正常腦組織，研磨后，加入細胞裂解液進行裂解，取各組細胞，加入細胞裂解液進行裂解。用Trizol總RNA提取試劑盒提取RNA，用反轉錄試劑進行反轉錄獲得模板單鏈cDNA，以cDNA為模板進行PCR。miR-210引物序列：上游 5’-GGAGATCTGAC CAGGTCATTTGCATAC-3’，下游5’-GGGAATTCG ATATGACCACACCTGTG-3’；U6引物序列：上游5’-TCAGTTTGCTGTTCTGGGTG-3’，下游5’-CGGTTG GCTGGAAAGGAG-3’； HIF-1α引物序列：上游5’-ATCGCGGGGACCGATT-3’，下游5’-CGACGTTCA GAACTTATCTTTTTCTT-3’；β-actin引物序列：上游5’-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3’，下游5’-TGTG GACTTGGGAGAGGACT-3’。反應條件：94 ℃ 60 s，92 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)進行36次循環(huán)。每個樣品均設置3個復孔。用2-ΔΔCt法獲得miR-210及HIF-1α mRNA的相對表達量。

1.5 MTT比色法檢測細胞增殖情況 取各組細胞接種于96孔板進行培養(yǎng)，將細胞密度調整為1×104個/孔，每組均設6個復孔。分別于轉染后24、48、72和96 h時，將20 μL的MTT液加入各孔，培養(yǎng)4 h，加入150 μL的DMSO，振蕩15 min，使結晶充分溶解后，用酶標儀對各孔570 nm處光密度(OD)值進行檢測。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移及侵襲能力 遷移能力檢測：取各組轉染培養(yǎng)48 h的細胞，接種于24孔板中，制備無血清細胞懸液，細胞密度2×104個/孔，將含體積分數10%胎牛血清的DMEM加入下室，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，取出小室，輕輕將上室的培養(yǎng)基去除，用甲醛固定5 min，利用結晶紫染色10 min，于倒置顯微鏡下取5個視野進行觀察拍照，計數穿膜細胞。侵襲能力檢測：將Matrigel膠均勻地鋪于Transwell小室上室，于37 ℃恒溫箱中預置1 h后配用。其余步驟同遷移能力檢測。

1.7 利用流式細胞術檢測細胞凋亡情況 取各組轉染后培養(yǎng)48 h的細胞，制備單細胞懸液，PBS洗滌3次，離心后棄去上清，重懸，室溫下孵育，用體積分數70%的乙醇固定25 min，用PBS沖洗，分別加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI，4 ℃避光孵育60 min后，用FACSAria流式細胞儀進行檢測，計算各轉染組細胞凋亡率。

1.8 Western blot法檢測細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表達 取各組轉染后培養(yǎng)48 h的細胞，加入細胞裂解液進行裂解，用總蛋白提取試劑盒對各組細胞中總蛋白進行提取，用BCA法對蛋白濃度進行檢測并加熱變性。各組取20 μg蛋白，在80 V條件下電泳30 min，在120 V條件下電泳90 min，之后電轉移至PVDF膜上，BSA封閉后，孵育過夜，用TBST洗滌3次，分別加入鼠抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9單克隆抗體(分別稀釋200、800、500、1 500、1 200倍)，孵育2 h，TBST洗滌3次，加入HRP標記二抗(稀釋2 000倍)，孵育2 h，用TBST洗滌3次，用ECL化學發(fā)光超敏試劑盒進行顯色，利用凝膠成像系統(tǒng)對獲得的條帶進行拍照并分析各蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 膠質瘤和正常腦組織中miR-210和HIF-1α mRNA表達的比較 膠質瘤組織中miR-210和HIF-1α mRNA相對表達量均高于正常腦組織，見表1。

表1 膠質瘤和正常腦組織中miR-210和HIF-1α mRNA表達的比較

2.2 不同病理特征人群膠質瘤組織中miR-210和HIF-1α mRNA表達的差異 膠質瘤組織中miR-210和HIF-1α mRNA的表達均與性別和年齡無關，而均與腫瘤直徑和病理分級有關，見表2。

表2 不同病理特征人群膠質瘤組織中miR-210和HIF-1α mRNA表達的差異

*：與腫瘤直徑<2 cm相比，P<0.05；#：與腫瘤直徑2～5 cm相比，P<0.05。

2.3 各組細胞中miR-210和HIF-1α mRNA表達的比較 反義miR-210組細胞中miR-210和HIF-1α mRNA相對表達量均低于陰性對照組和空白對照組，見表3。

表3 各組細胞中miR-210和HIF-1α mRNA表達的比較(n=3)

*：與陰性對照組和空白對照組相比，P<0.05。

2.4 各組細胞增殖情況比較 反義miR-210組細胞在48、72和96 h時OD值均低于陰性對照組和空白對照組，見圖1。

圖1 各組細胞增殖情況比較

2.5 各組細胞遷移和侵襲能力比較 反義miR-210組遷移細胞數和侵襲細胞數均低于陰性對照組和空白對照組，見表4和圖2。

表4 不同轉染組細胞遷移和侵襲能力比較(n=3)

*：與陰性對照組和空白對照組相比，P<0.05。

A：反義miR-210組；B：陰性對照組；C：空白對照組。圖2 不同轉染組細胞遷移(1)和侵襲(2)能力比較(×100)

2.6 各組細胞凋亡情況比較 反義miR-210組、陰性對照組和空白對照組細胞凋亡率分別為(27.8±4.9)%、(8.9±2.7)%和(9.2±2.9)%，差異有統(tǒng)計學意義(F=18.793，P<0.001)，反義miR-210組高于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)。

2.7 各組細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表達 反義miR-210組細胞中Bcl-2蛋白相對表達量低于陰性對照組和空白對照組，而Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白相對表達量均高于陰性對照組和空白對照組，見圖3和表5。

1：反義miR-210組；2：陰性對照組；3：空白對照組。圖3 各組細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的表達

表5 各組細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表達(n=3)

*：與陰性對照組和空白對照組相比，P<0.05。

3 討論

膠質瘤作為顱內頻發(fā)惡性腫瘤，由于其呈侵襲、浸潤性生長且血供豐富，患者在接受手術及放化療等手段治療后，往往預后不佳，復發(fā)率、病死率居高不下[5]。miRNA作為一類高度保守的短小RNA，在多種惡性腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。有研究[6]指出，miRNA參與了膠質瘤的發(fā)生、進展及侵襲、轉移，影響患者預后，不僅可用于膠質瘤臨床診斷，還有望成為基因治療的靶位。有研究[7]將膠質母細胞瘤細胞miR-21基因敲除，其增殖、侵襲性降低，凋亡加速。miR-210作為一種較為重要的miRNA，在細胞增殖、遷移、侵襲及DNA修復等多種生物學功能中發(fā)揮重要作用[8]。miR-210是低氧或缺氧誘導的miRNA類型，其表達受HIF-1α控制，HIF-1α可直接與miR-210啟動子起始位點上游的缺氧反應原件結合而誘導miR-210表達[9]。膠質瘤作為一種實體瘤，在生長過程中由于細胞大量增殖而大量消耗氧氣，會導致局部組織呈低氧或缺氧狀態(tài)，使HIF-1α表達上調[10]。該研究結果顯示，膠質瘤組織中miR-210和HIF-1α mRNA的表達均高于正常腦組織，說明膠質瘤組織呈低氧或缺氧狀態(tài)，使HIF-1α大量表達，從而促使miR-210表達上調。作者還發(fā)現，膠質瘤組織中miR-210和HIF-1α mRNA的表達與腫瘤直徑和病理分級有關，腫瘤直徑越大、病理分級越高，miR-210和HIF-1α mRNA的表達越高，提示miR-210高表達可能加速膠質瘤生長，而瘤體的生長又會加速組織缺氧，上調HIF-1α基因表達，而又進一步上調miR-210表達，加速膠質瘤進展。

為進一步探討miR-210在膠質瘤發(fā)生、進展中的作用，作者采用反義RNA技術特異性將U87細胞中miR-210基因進行抑制，結果顯示，反義miR-210組細胞中miR-210和HIF-1α mRNA相對表達量均低于陰性對照組和空白對照組，反義miR-210組細胞在48、72和96 h時OD值均低于陰性對照組和空白對照組，說明特異性下調miR-210表達后可減少U87細胞增殖，從而改善了細胞缺氧狀態(tài)，使HIF-1α基因表達下調，進一步減少miR-210的表達。該研究結果顯示，反義miR-210組遷移細胞數和侵襲細胞數均低于陰性對照組和空白對照組，提示特異性下調miR-210表達不僅可抑制細胞增殖，而且抑制U87細胞遷移及侵襲能力，進一步提示miR-210表達上調可能促進膠質瘤細胞侵襲轉移過程。該研究結果還顯示，反義miR-210組細胞凋亡率顯著高于陰性對照組和空白對照組，說明特異性下調miR-210表達可促進細胞凋亡的發(fā)生。

Bcl-2和Bax分別在線粒體家族中發(fā)揮抗凋亡及促凋亡作用，Bcl-2可通過抑制細胞凋亡而延長細胞壽命，通過阻斷線粒體細胞色素C的合成釋放而發(fā)揮抗細胞凋亡發(fā)生，Bax存在于線粒體內，是參與調控細胞凋亡的主要結構[11]。Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9作為半胱氨酸蛋白家族成員，是促凋亡蛋白[12]。該研究結果顯示，反義miR-210組細胞中Bcl-2蛋白相對表達量低于陰性對照組和空白對照組，而Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白相對表達量均高于陰性對照組和空白對照組，說明特異性下調miR-210可抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2表達，而促進凋亡促進蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達，通過激活兩條細胞凋亡路徑而促進細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，miR-210在膠質瘤組織中呈高表達；下調miR-210表達可抑制細胞增殖、遷移及侵襲，促進細胞凋亡發(fā)生，可能通過調控細胞凋亡路徑而實現對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調控，但具體作用機制尚待進一步研究明確；miR-210有望成為膠質瘤基因治療的潛在靶位。

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(2016-06-05收稿 責任編輯李沛寰)

Effects of down-regulation miR-210 expression on proliferation,invasion and apoptosis of U87 cells

RENZhiwen1),ZHAODong1),LIUQi1),WANGYang1),XUJian1),WANGYezhong1),ZHANGYongchao2)

1)DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospital,MedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832008 2)DepartmentofNeurosurgery,ShandongProvincialHospital,Jinan250021

miR-210;glioma;cell proliferation;cell invasion

Aim: To investigate the expression of miR-210 in glioma tissue and effects of antisense miR-210 on proliferation， invasion and apoptosis of U87 cells. Methods: The glioma tissue from 64 cases of patients with glioma and normal brain tissue from 30 patients undergoing decompression surgery were collected. The human glioma cells U87 were cultured and divided into antisense miR-210 group, negative control group and blank control group, according to different transfectant. The expressions of miR-210 and HIF-1α genes in different tissues and different transfected groups were detected by real-time PCR. The cell proliferations,migration and invasion as well as cell apoptosis in different transfected groups were detected by MTT,Transwell assay, and flow cytometry,respectively. The expressions of Bcl-2, Bax, Caspase-3, Caspase-8 and Caspase-9 proteins in the transfected groups were detected by Western blot. Results: The relative expression levels of miR-210 and HIF-1α mRNA in glioma tissue were higher than the normal brain tissue(P<0.05). The relative expression levels of miR-210 and HIF-1α mRNA in glioma tissue were related with tumor size and pathological grade(P<0.05).Compared with the negative control group and blank control group, the relative expression levels of miR-210 and HIF-1α mRNA in antisense miR-210 group and the density values at 48, 72 and 96 h were lower, the migration cells and invasion cells reduced, while the cell apoptosis rate increased(P<0.05). The relative expression level of Bcl-2 protein in antisense miR-210 group was lower than the negative control group and blank control group, while the relative expression levels of Bax, Caspase-3, Caspase-8 and Caspase-9 proteins were higher(P<0.05). Conclusion: miR-210 is highly expressed in glioma tissue. Down-regulating the expression of miR-210 could inhibit cell proliferation, migration and invasion, and promote apoptosis of U87 cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.018

*山東省科技發(fā)展計劃 2013YD18024

R651.1