高 萍， 夏桂雪， 包子?jì)梗?劉 雅， 程曉杰， 孔 明， 馮 超， 陳西廣

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003 )

殼聚糖的納米載體應(yīng)用于口服蛋白類藥物/疫苗遞送的研究?

高 萍， 夏桂雪， 包子?jì)梗?劉 雅， 程曉杰， 孔 明， 馮 超， 陳西廣??

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003 )

近年來，細(xì)菌性和病毒性的傳染性疾病已成為制約水產(chǎn)魚類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸?？诜庖咭蚱鋵?duì)魚體操作方便、無損失、不受時(shí)間地點(diǎn)及魚體大小的限制近年來得到了廣泛的關(guān)注。然而口服免疫因疫苗在通過魚的胃腸道時(shí)易被消化酶降解，導(dǎo)致免疫效率低下。因此，隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，基于殼聚糖的納米載體與水產(chǎn)疫苗的有效結(jié)合在魚類口服免疫領(lǐng)域越來越受到重視。本文利用離子交聯(lián)法和聚電解質(zhì)凝聚法分別合成了殼聚糖納米粒(CS-NPs)和殼聚糖/羧甲基殼聚糖復(fù)合納米粒(CS/CMCS-NPs)，其平均粒徑分別為(178 ± 6.27)和(255 ± 7.54 )nm，zeta電位分別為(+16.4 ± 0.51)和(+15.9 ± 0.37 )mV。納米粒對(duì)模式蛋白藥物牛血清白蛋白(BSA)的包封率分別為(42.9 ± 1.2)% 和(59.4 ± 3.2)%。紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)及MTT試驗(yàn)表明相較于CS-NPs，CS/CMCS-NPs具有更好的生物相容性。以熒光染料Cy5.5對(duì)納米載體進(jìn)行了熒光標(biāo)記來評(píng)價(jià)Caco-2細(xì)胞對(duì)熒光納米載體的攝取，結(jié)果表明，在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，Caco-2細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取存在一定的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。為了研究納米載體所包載的蛋白類藥物在大菱鲆體內(nèi)的分布情況，以FITC對(duì)BSA進(jìn)行熒光標(biāo)記，口服灌胃大菱鲆36 h后，對(duì)于FITC-BSA:CS-NPs組，熒光藥物主要分布在肝臟和前腸中；對(duì)于FITC-BSA:CS/CMCS-NPs組，熒光藥物主要分布在后腸、肝臟和脾臟中；作為對(duì)照組的FITC-BSA組，在肝臟中的熒光分布最強(qiáng)，由此可見，CS/CMCS-NPs能夠更有效的保護(hù)藥物到達(dá)大菱鲆的后腸，有望成為一種安全有效的口服蛋白疫苗運(yùn)送載體。

殼聚糖納米載體；口服免疫；牛血清白蛋白；大菱鲆

中國(guó)是世界最大的水產(chǎn)魚類養(yǎng)殖國(guó)，其養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界的61.7%。然而，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的急劇惡化，細(xì)菌性和病毒性的傳染性疾病已成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。疫苗免疫可以誘導(dǎo)魚體內(nèi)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)魚體抵抗疾病的能力。因此，通過疫苗免疫的方法獲得持久性的預(yù)防性免疫保護(hù)已獲得了廣泛的關(guān)注。與傳統(tǒng)的疫苗相比，新型疫苗具有安全性更好、免疫效率更高等優(yōu)點(diǎn)[1]。其主要類型有亞單位疫苗、基因工程疫苗、合成肽疫苗和DNA疫苗等。蛋白類抗原因其具有較強(qiáng)的免疫原性進(jìn)而誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)而受到研究者的極大關(guān)注[2-3]。

目前，魚類的接種方法主要有3種，分別為注射、口服和浸浴。根據(jù)魚類自身的特點(diǎn)，口服免疫因其對(duì)魚體操作方便、無損失、不受時(shí)間地點(diǎn)及魚體大小的限制及減少對(duì)環(huán)境的污染等優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛的關(guān)注[4]。但口服免疫也有一些缺點(diǎn)，其免疫效率相對(duì)較低。原因?yàn)橐呙缭谕ㄟ^魚的消化道時(shí)會(huì)被胃中的消化酶降解，失去免疫原性，因此導(dǎo)致疫苗的免疫效率低下。為了保護(hù)疫苗免遭破壞，可用于口服的安全有效的載體包載抗原是一種有效的方法[5]。在過去的幾十年，納米技術(shù)被廣泛的用于藥物和疫苗學(xué)[6-7]，呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)的模式，應(yīng)運(yùn)產(chǎn)生了納米疫苗(Nanovaccinology)[8]。納米載體可以有效的保護(hù)抗原以防止在胃腸道中被降解、延長(zhǎng)抗原在胃腸道中的停留時(shí)間以及增強(qiáng)抗原被腸道相關(guān)淋巴組織的攝取等。甲殼素是自然界中天然存在的含量?jī)H次于纖維素的第二大類多糖，殼聚糖是甲殼素脫N-乙?；蟮囊环N陽離子聚合物[9]。殼聚糖納米載體因其良好的生物可降解性、生物相容性和無毒性而在醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[10-12]。據(jù)報(bào)道，魚類胃中的pH環(huán)境可達(dá)2.0，前腸的pH為4.5左右，后腸的pH可達(dá)8.5～9.0[13]。而研究表明魚類后腸部位分布有更多與免疫相關(guān)的淋巴細(xì)胞，因此納米載體如何有效的保護(hù)抗原達(dá)到魚類的后腸是開發(fā)新載體首先要考慮的重要因素。

本文以殼聚糖(CS)及其水溶性的羧甲基殼聚糖(CMCS)為原料，制備了殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米載體(CS/CMCS-NPs)用于口服疫苗的遞送，評(píng)價(jià)了納米粒的生物相容性及細(xì)胞攝取率，并以牛血清白蛋白(BSA)作為模式蛋白進(jìn)行了載藥納米粒相關(guān)性質(zhì)的研究及藥物在大菱鲆體內(nèi)的分布，以探討該納米載體作為蛋白類疫苗口服輸送載體的可行性。

1 材料與方法

1.1 納米載體的制備

1.1.1 CS納米載體(CS-NPs)的制備 采用離子交聯(lián)的方法制備了CS-NPs。三聚磷酸鈉(TPP)作為交聯(lián)劑。將殼聚糖(分子量MW: 150 kDa， 脫乙酰度DD: 92%)溶于0.1 mol/L醋酸溶液中得到CS濃度為1 mg/mL，調(diào)節(jié)CS溶液至pH=5.0。在室溫和磁力攪拌的條件下，將濃度為 1 mg/mL TPP溶液緩慢逐滴加入到CS溶液(V∶V = 6∶1)中，直至出現(xiàn)白色乳光，在滴加過程中不斷的攪拌，反應(yīng)進(jìn)行2 h，得到CS-NPs。

1.1.2 CS與CMCS復(fù)合納米載體(CS/CMCS-NPs)的制備 采用聚電解質(zhì)凝聚的方法制備CS/CMCS-NPs[14]。將1 mL TPP溶液逐滴滴入5 mL CS溶液中，邊滴加邊攪拌1 h，在室溫和磁力攪拌的條件下，將濃度為0.5 mg/mL的4 mL CMCS溶液(分子量為170 kDa，羧甲基取代度DS 92%)滴加入上述混合溶液中，得到CS/CMCS-NPs。

1.2 納米載體的表征

1.2.1 平均粒徑和zeta電位 利用動(dòng)態(tài)光散射的方法通過激光粒度儀測(cè)定了BSA:CS-NPs和BSA:CS/CMCS-NPs的平均粒徑和zeta電位。檢測(cè)波長(zhǎng)633 nm，檢測(cè)角為90°，每個(gè)樣品測(cè)三次重復(fù)。

1.2.2 透射電鏡(TEM)觀察 通過透射電鏡觀察BSA:CS-NPs和BSA:CS/CMCS-NPs的形態(tài)。分別將兩種納米懸液滴加至銅網(wǎng)上，濾紙吸干表面液體，干燥，于透射電鏡下觀察納米粒的形態(tài)。

1.3 包載BSA的納米粒的制備及包封率的計(jì)算

1.3.1 包載BSA的納米粒的合成 BSA:CS-NPs的制備參照CS-NPs的合成方法。CS溶液與BSA溶液(1 mg/mL)的體積比6∶4。BSA:CS/CMCS-NPs的合成方法參照CS/CMCS-NPs的合成法。將4 mL 1 mg/mL的BSA溶液與4 mL CMCS溶液混合均勻，后將CS醋酸溶液緩慢逐滴加入上述溶液中，在室溫和磁力攪拌的條件下，逐滴加入TPP，繼續(xù)攪拌2 h。

1.3.2 包封率的計(jì)算 納米粒對(duì)BSA的包封率和載藥量進(jìn)行了測(cè)定，方法如下：取新制備的包載BSA的納米粒懸液2 mL于離心管中，18 000 r/s，4 ℃離心30 min，取上清液，用BCA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)檢測(cè)其中的BSA的含量。按照以下公式計(jì)算納米顆粒載BSA的包封率(Encapsulation efficiency，EE)和載藥量(Loading content，LC)。

EE(%)=

1.4 納米載體的生物相容性檢測(cè)

1.4.1 血液相容性 大菱鲆(50～60g，青島忠海水產(chǎn)有限公司)采用尾椎靜脈取血的方法，采集得到的血液收集于抗凝管中，加入等體積的0.9% 生理鹽水混勻，于4 ℃ 1 000r/s離心10min，棄上清液，加入0.9% 生理鹽水配制紅細(xì)胞懸液至終濃度為0.5 % (V/V) 。分別取新制備的100μL紅細(xì)胞懸液加入到不同濃度的(1mg/mL，2mg/mL)CS和CS/CMCS納米懸液中，于37 ℃恒溫振蕩器震蕩1h后，1 000r/s離心10min。取上清液于545nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值(OD)。溶血率(Hemolysisrate,HR%)計(jì)算公式如下：

其中：ODP為陽性對(duì)照組吸光度值；ODN為陰性對(duì)照組吸光度值；ODs為材料組吸光度值。

1.4.2 細(xì)胞相容性 噻唑藍(lán)比色法(MTT法)是目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的方法，常被用于材料對(duì)細(xì)胞的毒性檢測(cè)等。利用MTT法(美國(guó)Sigma公司)評(píng)價(jià)了不同濃度(0.125、0.25、0.5 和1mg/mL)的CS-NPs和CS/CMCS-NPs對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)的細(xì)胞毒性。

1.5 熒光納米載體的細(xì)胞攝取

以分子藥物熒光標(biāo)記為代表的熒光標(biāo)記技術(shù)，為示蹤細(xì)胞對(duì)納米載體的攝取及定量研究提供了便利。以熒光染料Cy5.5(北京泛博生物化學(xué)有限公司)對(duì)CS進(jìn)行了標(biāo)記。成功制備了Cy5.5-CS和Cy5.5-CS/CMCS納米顆粒。

1.5.1Caco-2細(xì)胞對(duì)熒光納米載體攝取的激光共聚焦顯微鏡觀察 細(xì)胞對(duì)納米粒攝取的定量檢測(cè)參照Khin等[15]的方法。將細(xì)胞密度約為 5×104/mL的Caco-2細(xì)胞接種于無菌激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h，加入2mL新鮮配制的Cy5.5-CS和Cy5.5-CS/CMCS納米懸液(0.5mg/mL，D-Hank’s緩沖液作為溶劑)，分別培養(yǎng)1、2、4h。到預(yù)設(shè)的時(shí)間，用D-Hank’s緩沖液(Hyclone公司)輕微沖洗細(xì)胞單層3次，加入DAPI工作液(北京索萊寶科技有限公司)繼續(xù)孵育15min后用D-Hank’s緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1mLD-Hank’s緩沖液，通過激光共聚焦掃描顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)觀察對(duì)熒光納米粒的吞噬。

1.5.2Caco-2細(xì)胞對(duì)熒光納米粒攝取的定量測(cè)定 將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細(xì)胞24h后，加入新配制的D-Hank’s緩沖液梯度稀釋Cy5.5-CS和Cy5.5-CS/CMCS納米懸液(濃度分別為50、100、200μg/mL)，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔200μL。分別培養(yǎng)1、2和4h后，用熒光酶標(biāo)儀(Ex/Em= 673/692nm)檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞對(duì)熒光納米顆粒的細(xì)胞攝取率：

其中：Wsample為細(xì)胞攝取的Cy5.5的含量；Wtotal為96孔板中所加入的Cy5.5的總含量。

1.6 熒光藥物在組織中的分布

為了探究CS/CMCS-NPs作為口服蛋白抗原載體的可行性，以FITC(美國(guó)Sigma公司)對(duì)模式蛋白藥物BSA進(jìn)行了熒光標(biāo)記，合成了FITC-BSA:CS-NPs和FITC-BSA:CS/CMCS-NPs。將健康的大菱鲆隨機(jī)分為3組，分別用無菌灌喂針灌喂大菱鲆500μLFITC-BSA:CS納米懸液(15μgFITC-BSA/ 每克魚)和FITC-BSA:CS/CMCS-納米懸液(15μgFITC-BSA/ 每克魚)。對(duì)照組灌喂500μLFITC-BSA。對(duì)大菱鲆進(jìn)行口服灌喂36h后，將其置于冰上5min，用解剖剪解剖大菱鲆，分離出心臟、肝臟、脾臟、腸和腎臟等器官，利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察各器官中的熒光強(qiáng)度。另一部分離體的心臟、肝臟、脾臟、前腸、后腸和腎臟等器官吸干表面的血跡后，稱重，將組織置于5mL離心管中，加入2mL含0.1mol/LTris-HCl，2mmol/LEDTA和0.1 %TritonX-100的緩沖液(pH=7.4)中研磨均勻，靜置10min使組織充分裂解。將組織勻漿于 5 000r/s勻漿15min，取上清用熒光酶標(biāo)儀(Ex/Em= 475/525nm)測(cè)定各組織中的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米載體的制備與表征

CS-NPs和CS/CMCS-NPs的平均粒徑、zeta電位及粒徑分布系數(shù)見表1所示。CS/CMCS-NPs的粒徑大于CS-NPs的粒徑，表明CMCS的引入使得納米粒的粒徑增大。與CS-NPs相比，CS/CMCS-NPs具有更小的多分散系數(shù)，zeta電位的絕對(duì)值更高，表明CS/CMCS-NPs的分散性更加均一，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。納米粒的透射電鏡圖(見圖1)也證明此觀點(diǎn)。透射電鏡如圖1所示。

表1 CS-NPs 和 CS/CMCS-NPs的平均粒徑、多分散系數(shù)和zeta電位Table 1 Mean particle size, polydispersity index (PDI) and zeta potential of CS-NPs and CS/CMCS-NPs

圖1 CS-NPs (A)和CS/CMCS-NPs (B)的透射電鏡圖

2.2 載藥納米粒的性質(zhì)研究及包封率的計(jì)算

BSA:CS-NPs和BSA:CS/CMCS-NPs的平均粒徑，PDI和zeta電位及包封率如表2所示?？梢钥闯?，CMCS的加入增大了BSA:CS/CMCS-NPs平均粒徑，BSA:CS-NPs和BSA:CS/CMCS-NPs兩種納米粒的zeta電位的絕對(duì)值均大于15，表明納米粒具有相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。BSA:CS-NPs對(duì)BSA的包封率和包載量分別為42.9%和12.8%，而BSA:CS/CMCS對(duì)BSA的包封率和包載量分別為59.4% 和18.5%，均高于CS-NPs的包封率和載藥量，可見CMCS的加入，提高了納米載體對(duì)藥物的包封率和載藥量。

表2 BSA:CS-NPs 和 BSA:CS/CMCS-NPs的平均粒徑、多分散系數(shù)和zeta電位、包封率和包載量

2.3 納米載體的生物相容性檢測(cè)

2.3.1 血液相容性檢測(cè) 溶血是指紅細(xì)胞破裂溶解的現(xiàn)象。導(dǎo)致溶血的因素有很多。納米顆粒進(jìn)入機(jī)體后，與血液中的紅細(xì)胞或血漿蛋白相互作用，可能導(dǎo)致溶血現(xiàn)象的發(fā)生。國(guó)際對(duì)安全的生物材料在溶血率方面的要求為溶血率低于5%[16]。不同濃度的CS-NPs和CS/CMCS-NPs對(duì)紅細(xì)胞的溶血情況見表3所示。低濃度組(1mg/mL)的CS-NPs和CS/CMCS-NPs與紅細(xì)胞作用1h后的溶血率分別為(1.96 ± 0.07)% 和(1.55 ± 0.08)%，低于高濃度(2mg/mL)CS-NPs和CS/CMCS-NPs的紅細(xì)胞溶血率(3.29 ± 0.08)% 和(2.53 ± 0.06)% 。同時(shí)，對(duì)于相同的濃度組，CS-NPs對(duì)紅細(xì)胞的溶血率高于CS/CMCS-NPs的溶血率，表明CS/CMCS-NPs具有更好的血液相容性。但2種納米粒對(duì)紅細(xì)胞的溶血率仍低于5 %，符合對(duì)生物材料的安全標(biāo)準(zhǔn)。

表3 CS-NPs 和 CS/CMCS-NPs的溶血率

2.3.2 細(xì)胞相容性檢測(cè) 不同濃度(0.125、0.25、0.5、1mg/mL)的CS-NPs和CS/CMCS-NPs在24、48和72h對(duì)細(xì)胞的毒性影響如圖2所示。CS/CMCS-NPs實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增長(zhǎng)率高于90%，CS-NPs處理組細(xì)胞的增值率高于80%，相對(duì)于CS-NPs，經(jīng)CS/CMCS-NPs處理的實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞的增殖影響更小。根據(jù)ISO10993-5 手冊(cè)中關(guān)于MTT細(xì)胞毒性檢驗(yàn)中的規(guī)定，當(dāng)材料與細(xì)胞共孵育24h后，經(jīng)材料處理的細(xì)胞增殖率低于70%， 則認(rèn)為該材料具有潛在的細(xì)胞毒性[17]。因此，CS-NPs(見圖2A) 和CS/CMCS-NPs(見圖2B)對(duì)Caco-2均沒有細(xì)胞毒性，相較于CS-NPs，CS/CMCS-NPs具有更好的細(xì)胞相容性。

圖2 CS-NPs(A)和 CS/CMCS-NPs(B)對(duì)Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.2 In vitro cytotoxicity of CS-NPs(A)and CS/CMCS-NPs in Caco-2 cells

2.4Caco-2細(xì)胞對(duì)熒光納米載體的攝取

2.4.1Caco-2 細(xì)胞對(duì)熒光納米粒攝取的激光共聚焦顯微鏡觀察 為了模擬腸道細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取，以Caco-2 細(xì)胞為模型，分別將200μg/mL的Cy5.5-CS-NPs(見圖3A) 和Cy5.5-CS/CMCS-NPs(見圖3B)與細(xì)胞共孵育1、2、4h，用激光共聚焦顯微鏡觀察納米粒在細(xì)胞內(nèi)的分布，如圖3所示。圖中藍(lán)色的熒光為DAPI，所染部位為細(xì)胞核，紅色熒光為Cy5.5所標(biāo)記的納米粒，2種納米粒處理組中細(xì)胞中均可觀察到紅色的熒光，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，紅色熒光逐漸的由細(xì)胞的表面擴(kuò)散至細(xì)胞質(zhì)中，且熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，表明隨時(shí)間的延長(zhǎng)，有更多的納米顆粒被細(xì)胞吞噬，是一個(gè)時(shí)間依賴性的過程。

2.4.2Caco-2 細(xì)胞對(duì)熒光納米粒攝取的定量測(cè)定

2.4.2.1 納米粒的濃度對(duì)細(xì)胞攝取的影響 測(cè)定了不同濃度(50、100、200μg/mL)的Cy5.5-CS-NPs和Cy5.5-CS/CMCS-NPs在與Caco-2細(xì)胞共孵育4h后的細(xì)胞攝取率，如圖4所示。圖中可以看出，在相同的時(shí)間內(nèi)，隨著納米粒濃度的增大，Caco-2對(duì)納米粒的攝取率逐漸的增大。共孵育4h后，低濃度組(50μg/mL)的Cy5.5-CS-NPs和Cy5.5-CS/CMCS-NPs的細(xì)胞攝取率分布為1.25% 和1.20%，而高濃度組的細(xì)胞吞噬率分別為4.08% 和4.78%，說明Cy5.5-CSNPs和Cy5.5-CS/CMCSNPs的細(xì)胞攝取率有一定的濃度依賴性。

圖3 Caco-2細(xì)胞在不同時(shí)間內(nèi)(1 、2 、4 h)對(duì)濃度為200 μg/mL 的Cy5.5-CS-NPs(A)和Cy5.5-CS/CMCS-NPs(B)的攝取(37 ℃)

圖4 Caco-2 細(xì)胞對(duì)不同濃度的Cy5.5-CS-NPs 和Cy5.5-CS/CMCS-NPs的攝取率

2.4.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞攝取的影響 在納米粒與Caco-2細(xì)胞共孵育1、2、4h后，細(xì)胞對(duì)濃度為200μg/mL的Cy5.5-CS-NPs和Cy5.5-CS/CMCS-NPs的攝取情況如圖5所示。可見，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Caco-2細(xì)胞對(duì)2種納米粒的攝取率逐漸的增大。

圖5 Caco-2細(xì)胞與納米粒共孵育時(shí)間(1、2、4 h)對(duì)細(xì)胞攝取率的影響

2.5 口服載藥熒光納米顆粒在大菱鲆體內(nèi)的組織分布

為了示蹤蛋白藥物在大菱鲆腸道內(nèi)的分布，以FITC-BSA為模式蛋白，利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了FITC-BSA在大菱鲆體內(nèi)的分布情況。如圖6所示，在口服灌胃12h后，F(xiàn)ITC-BSA在胃腸道中均有分布，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，36h后，大菱鲆胃腸中的熒光信號(hào)減弱。

圖6 口服FITC-BSA溶液36 h后在大菱鲆體內(nèi)的分布

2.5.1 載藥熒光納米粒的組織分布的定性檢測(cè) 為了檢測(cè)載藥熒光納米粒在機(jī)體內(nèi)的滲透效果，對(duì)大菱鲆口服灌胃FITC-BSA:CS和FITC-BSA:CS/CMCS納米懸液36h后處死大菱鲆，取心臟、肝臟、脾臟、腸和腎臟在小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察FITC-BSA在大菱鲆體內(nèi)的分布情況，結(jié)果如圖7所示。圖中可以看出，PBS對(duì)照組沒有檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)，F(xiàn)ITC-BSA:CS/CMCS-NPs組在后腸中檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)，F(xiàn)ITC-BSA:CS-NPs組檢測(cè)到相對(duì)較弱的熒光信號(hào)，而FITC-BSA實(shí)驗(yàn)組在腸道無明顯的熒光信號(hào)。

圖7 體內(nèi)熒光成像觀察FITC-BSA在大菱鲆組織中的分布

2.5.2 載藥熒光納米粒的組織分布的定量檢測(cè) 口服灌胃FITC-BSA:CS和FITC-BSA:CS/CMCS納米懸液36 h后，將大菱鲆處死，取出心臟、肝臟、脾臟、前腸、后腸和腎臟，稱重后進(jìn)行組織勻漿，離心取上清液，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)各組織上清液中的熒光強(qiáng)度(見圖8)。對(duì)于FITC-BSA:CS-NPs和FITC-BSA:CS/CMCS-NPs組，口服納米顆粒36 h后，熒光納米顆粒主要分布在腸道、肝臟，而對(duì)于沒有載體包載的FITC-BSA組，熒光納米顆粒主要分布肝臟等。原因?yàn)榧{米顆粒經(jīng)口服進(jìn)入大菱鲆的機(jī)體，由于殼聚糖的納米顆粒具有一定的黏膜粘附性，36 h后大菱鲆腸道中仍然分布著較高劑量的納米顆粒。對(duì)于FITC-BSA:CS-NPs組，載藥熒光納米粒主要分布在肝臟和前腸中，其分布含量由大到小的順序?yàn)楦闻K>前腸>脾臟>腎臟>后腸。而對(duì)于FITC-BSA:CS/CMCS-NPs組，熒光納米粒主要分布在后腸、肝臟和脾臟中，其分布順序?yàn)楹竽c>肝臟>脾臟>腎臟。作為對(duì)照組的FITC-BSA組，在肝臟中的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，其順序?yàn)楦闻K>心臟>腎臟。

3 討論

近年來，在水產(chǎn)魚類病害防治領(lǐng)域，口服免疫因其操作簡(jiǎn)單并且可以誘導(dǎo)粘膜免疫和系統(tǒng)免疫等優(yōu)點(diǎn)而引起了廣泛的關(guān)注。然而高效的蛋白類、多肽類的疫苗在口服接種的過程中由于惡劣的胃腸環(huán)境易導(dǎo)致疫苗的失活或降解，限制了口服免疫的應(yīng)用范圍。隨著納米技術(shù)在藥物及免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，納米輸送載體成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。納米載體具有一些良好的性質(zhì)，使其在口服免疫方面具有一定的優(yōu)越性，例如對(duì)藥物或疫苗的可控性緩釋，可以延長(zhǎng)藥物或疫苗的作用時(shí)間；有效的保護(hù)藥物或疫苗防止被降解或破壞，提高疫苗的穩(wěn)定性。研究表明魚類的后腸相較于前腸分布有更多與免疫相關(guān)的淋巴組織[13, 18-19]，因此選擇一種功能化的納米載體對(duì)疫苗進(jìn)行有效包載保護(hù)其到達(dá)魚類的后腸并且增強(qiáng)疫苗透黏膜的能力是增強(qiáng)免疫反應(yīng)的重要因素。

圖8 口服納米顆粒后大菱鲆各組織中熒光藥物的分布

通過離子交聯(lián)法和聚電解質(zhì)凝聚法分別制備了納米載體CS-NPs和CS/CMCS-NPs，該方法制備工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和。CS是一種天然的陽離子聚合物，在酸性環(huán)境中，分子中的-NH2基團(tuán)發(fā)生質(zhì)子化作用帶正電，可以與帶負(fù)電的TPP交聯(lián)成納米球。CMCS分子鏈上有大量的羧甲基基團(tuán)，其解離常數(shù)pKa為2.0～4.0，在pH=5.0的環(huán)境中帶負(fù)電荷，可以與帶正電的CS發(fā)生靜電作用而成納米粒。同時(shí)，交聯(lián)劑TPP的加入使得CS/CMCS復(fù)合納米粒的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。研究表明，pH 對(duì)包載藥物的納米粒的平均粒徑具有重要的影響，本研究中，當(dāng)溶液pH 接近5時(shí)，具有最小的平均粒徑。原因可能為BSA的等電點(diǎn)為4.7左右，在接近或超過BSA的等電點(diǎn)時(shí)，TPP和BSA表面帶有較多的負(fù)電荷，更易于和帶正電的殼聚糖進(jìn)行交聯(lián)，因此，形成更緊實(shí)的納米顆粒，粒徑更小。同時(shí)，顆粒的形狀是影響抗原呈遞細(xì)胞如樹突細(xì)胞對(duì)抗原吞噬效率的重要因素。原因?yàn)闃渫患?xì)胞對(duì)顆粒的吞噬效率與兩者接觸面的固有形態(tài)密切相關(guān)。與蠕蟲狀顆粒相比，球形的顆粒具有更強(qiáng)的細(xì)胞吞噬效率[20]。圖中CS/CMCS-NPs復(fù)合納米粒具有更好的球形形態(tài)，分散良好。

利用溶血試驗(yàn)和MTT試驗(yàn)分別評(píng)價(jià)了CS-NPs和CS/CMCS-NPs的生物相容性，溶血試驗(yàn)表明對(duì)于相同的濃度組，CS-NPs對(duì)紅細(xì)胞的溶血率高于CS/CMCS-NPs的溶血率，但溶血率仍低于5%。MTT毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的納米粒對(duì)Caco-2細(xì)胞的增值率的影響，納米粒在0.125～1 mg/mL的范圍內(nèi)，對(duì)細(xì)胞的增值率沒有顯著的影響，但相對(duì)于CS-NPs，CS/CMCS-NPs具有更好的細(xì)胞相容性。結(jié)合溶血試驗(yàn)，表明CS/CMCS-NPs具有良好的生物相容性。

納米粒的濃度對(duì)細(xì)胞攝取的影響表明，在一定濃度范圍內(nèi)，納米粒的濃度與細(xì)胞的攝取率存在正比例關(guān)系。研究表明，細(xì)胞對(duì)殼聚糖的納米粒的攝取主要是通過納米粒子表面的正電荷與細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷的靜電作用非特異性的被細(xì)胞攝取[21]。而這種非特異性的內(nèi)吞作用取決于納米粒子表面的電荷密度與細(xì)胞膜上的負(fù)電荷的密度，當(dāng)納米粒在低濃度與細(xì)胞作用時(shí)，細(xì)胞的攝取量與納米粒濃度成正比；當(dāng)納米粒濃度增大到一定程度后，其相對(duì)攝取率減小，原因可能為細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取量逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)。時(shí)間對(duì)細(xì)胞攝取的影響表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Caco-2細(xì)胞對(duì)兩種納米粒的攝取率逐漸的增大。細(xì)胞在最初的2 h內(nèi)對(duì)納米顆粒的攝取速度最快，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，攝取速度逐漸的減慢，共孵育6 h后，攝取速度基本不變。原因可能為細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取與外排達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，而本研究中，Caco-2細(xì)胞與納米顆粒共孵育4 h內(nèi)，細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取率與培養(yǎng)時(shí)間存在一定的正比例關(guān)系，說明細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取還未達(dá)到飽和。

載藥熒光納米粒的組織分布的定性檢測(cè)表明，口服灌喂大菱鲆36 h后，不同的實(shí)驗(yàn)組熒光藥物的分布差異較大。相對(duì)于CS-NPs載體，CS/CMCS-NPs載體在腸道中具有更廣泛的pH響應(yīng)性，因此在后腸堿性環(huán)境中具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，可以保護(hù)FITC-BSA到達(dá)大菱鲆的后腸，防止在前腸中被上皮細(xì)胞吞噬。而后腸中分布著的大量的與免疫反應(yīng)密切相關(guān)的淋巴細(xì)胞。在后腸中，隨著pH的增大，具有pH響應(yīng)的CS/CMCS 納米粒結(jié)構(gòu)逐漸崩解，逐漸釋放出FITC-BSA，但是由于后腸中的蛋白酶比前腸相對(duì)少，松散的納米粒被吸附到后腸表面，通過淋巴循環(huán)到達(dá)脾和腎等主要的免疫器官，因此在脾臟和腎臟中分布有較多的熒光藥物。對(duì)于CS-NPs組，由于其在堿性環(huán)境中的不穩(wěn)定，在前腸中對(duì)FITC-BSA釋放的較快。而對(duì)于無載體包載的FITC-BSA，容易被前腸中的酶降解為氨基酸，進(jìn)入血液中，而沒有進(jìn)入淋巴循環(huán)。因此，最多量的熒光藥物分布在肝臟中，原因?yàn)楦闻K是解毒和代謝的器官，而在脾臟和腎臟免疫器官中的分布極微量。

綜上，本研究表明了制備的納米粒的球形完整，分布較均一，并且CS/CMCS-NPs具有良好的生物相容性。納米載體CS/CMCS-NPs對(duì)BSA具有較高的包封率，并且可以保護(hù)所包載的藥物到達(dá)魚類的后腸，因此，該納米顆粒有望成為一種安全有效的口服疫苗運(yùn)送載體。本研究中，以BSA作為模式蛋白藥物對(duì)納米載體進(jìn)行了相關(guān)的評(píng)價(jià)，然而，蛋白類及多肽類疫苗的分子量更大、結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，我們將在以后的研究中進(jìn)一步探討。

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責(zé)任編輯 高 蓓

The Application of Chitosan-Based Nanocarrier for Oral Protein Drug/Vaccine Delivery

GAO Ping, XIA Gui-Xue, BAO Zi-Xian, LIU Ya, CHENG Xiao-Jie,KONG Ming, FENG Chao, CHEN Xi-Guang

(College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

In recent years, infectious bacterial and viral diseases have restricted the development of fish aquaculture. Oral immunization of fish has caused extensive attention because of its convenient operation with no restricted time, place, the sizes and no injury to fish. But oral vaccine may be degraded by digestive enzymes in the gastrointestinal tract (GI), which lead to the low immune efficiency. Therefore, with the rapid development of nanotechnology, the potent combination of chitosan (CS) based-nanocarriers with aquatic vaccines has caused much attention in the field of fish oral vaccination. Chitosan-nanoparticles (CS-NPs) and chitosan/carboxymethyl chitosan-nanoparticles (CS/CMCS-NPs) were prepared by ionic gelation and polyelectrolyte complexation method, respectively. Their average particle sizes were (178 ± 6.27)and (255 ± 7.54) nm, respectively. The zeta potential was (+15.9 ± 0.37) and (+16.4 ± 0.51) mV, respectively. The model protein of bovine serum albumin (BSA) was encapsulated in nanoparticles with the encapsulation efficiency (EE) of (42.9 ± 1.2)% and (59.4 ± 3.2)%, respectively. The hemolysis and MTT assay showed that CS/CMCS-NPs exhibited better biocompatibility compared with CS-NPs. In order to evaluate cellular uptake efficiency of nanoparticles by Caco-2 cells, the nanocarriers were labeled with Cy5.5. The results showed that the cellular uptake efficiency revealed concentration-dependence and time-dependence in the certain range of concentration and time. For the sake of tracing the biodistribution of BSA encapsulated in nanoparticles, BSA was labeled with FITC. After oral administration in turbot with nanoparticles 36 hours later, the fluorescent proteins were mainly distributed in liver and foregut with the group of FITC-BSA:CS-NPs, while in hindgut, liver and spleen with the group of FITC-BSA:CS/CMCS-NPs. As for the control group, there were mainly distributed in liver. Thus, CS/CMCS-NPs could effectively protect the protein to reach the hindgut of turbot and had great potential to be applied as safe and effective oral vaccine delivery.

chitosan nanocarrier；oral vaccination；bovine serum albumin；turbot

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31500807)；中國(guó)博士后基金項(xiàng)目(2014M560579)；青島市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(15-9-1-73-jch)資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (31500807); The National Science Foundation for Post-doctor (2014M560579)； Applied Basic Research Plan of Qingdao (15-9-1-73-jch)

2015-06-07；

2015-07-15

高 萍(1985-)，女，博士生，主要從事海洋生物材料研究。E-mail:gaoping1221@163.com

?? 通訊作者：E-mail: xgchen@ouc.edu.cn

R944.1；Q819

A

1672-5174(2017)05-072-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160213

高萍， 夏桂雪， 包子?jì)梗?等. 殼聚糖的納米載體應(yīng)用于口服蛋白類藥物/疫苗遞送的研究[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 47(5): 72-79.

GAO Ping, XIA Gui-Xue, BAO Zi-Xian, et al. The application of chitosan-based nanocarrier for oral protein drug/vaccine delivery[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(5): 72-79.