徐 文，雷 迪，張 靖，徐 江，黃志海，丘小惠，Julie A.Hawkins＊＊＊，陳士林＊＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院/中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣東分院 廣州 510006；2. 雷丁大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院 英國(guó) RG6 6AH；3. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

雞血藤精準(zhǔn)煮散飲片與原飲片質(zhì)量的對(duì)比性研究＊

徐 文1＊＊，雷 迪2，張 靖1，徐 江3，黃志海1，丘小惠1，Julie A.Hawkins2＊＊＊，陳士林3＊＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院/中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣東分院 廣州 510006；2. 雷丁大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院 英國(guó) RG6 6AH；3. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

目的：本研究采用化學(xué)指紋圖譜法及DNA條形碼分子鑒定技術(shù)對(duì)雞血藤飲片煮散質(zhì)量體系進(jìn)行探索研究。方法：應(yīng)用ITS2序列作為DNA條形碼對(duì)雞血藤進(jìn)行鑒定，對(duì)比雞血藤原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片的出膏率；收集3個(gè)批次雞血藤飲片，采用HPLC法進(jìn)行3批次飲片混合粉碎前后質(zhì)量均一性、指紋圖譜與相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：ITS2序列對(duì)雞血藤藥材可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定。雞血藤煮散飲片出膏率及指標(biāo)成分表兒茶素含量均略高于原飲片；原飲片批間表兒茶素溶出量有明顯差異性RSD為11.0%，混合后制成煮散飲片后差異性明顯降低RSD為1.0%。指紋圖譜中14個(gè)共有峰相對(duì)峰面積均有所提高，RSD值明顯減少。結(jié)論：雞血藤精準(zhǔn)煮散飲片提高原飲片的浸出率，成分溶出率及質(zhì)量均一性，表明雞血藤煮散飲片有較好的的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

精準(zhǔn)煮散飲片 雞血藤 均一性 DNA條形碼 質(zhì)量體系

雞血藤為豆科植物密花豆Spatholobus suberectusDunn.的干燥藤莖，具有補(bǔ)血、活血、通絡(luò)的功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、血虛萎黃、風(fēng)濕痹痛等癥，主產(chǎn)于廣西、廣東，以野生藥材入藥[1]。雞血藤中主要含黃酮類、有機(jī)酸、蒽醌類、甾體及三萜類等化學(xué)成分[2，3]。由于近年來(lái)的過(guò)度砍伐與利用，其野生資源蘊(yùn)藏量不斷下降，一些比較細(xì)的或達(dá)不到入藥要求的藤莖亦被采挖和藥用，因而雞血藤藥材的質(zhì)量參次不齊，其化學(xué)成分含量差異非常大[4-6]，直接影響臨床用藥療效及穩(wěn)定性。因此需要一種易于鑒定和檢測(cè)，可經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備、規(guī)?；a(chǎn)、質(zhì)量均一的方法，以提高臨床用藥療效穩(wěn)定的新型飲片。

本課題組前期研究提出的“精準(zhǔn)煮散飲片”理論體系[7]，其實(shí)質(zhì)是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化工藝將中藥飲片的形狀規(guī)格微小化、均勻化處理，使飲片批量規(guī)模穩(wěn)定化，批內(nèi)質(zhì)量均一化，實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確、高效的自動(dòng)化分裝、調(diào)劑、煎煮流程，提高臨床湯劑用藥的穩(wěn)定有效。中藥煮散起源于先秦，盛行于唐宋，是將中藥粉碎成一定粒度與水共煎，去渣取汁制成的中藥液體制劑。通過(guò)將藥材粉碎，制成煮散，有利于提高藥材煎煮效率，減少藥材使用量，具有省材、省時(shí)之特點(diǎn)[8-10]。煮散的缺點(diǎn)在于粉碎過(guò)程中破壞藥材形態(tài)，喪失藥物鑒別特征，導(dǎo)致“辨藥之難”，逐步被中藥飲片所取代[11，12]。近年來(lái)，隨著中藥DNA條形碼鑒定體系及中藥指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展為構(gòu)成精準(zhǔn)化的中藥質(zhì)量控制體系，提供精準(zhǔn)化的中藥識(shí)別溯源與檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)藥品基源、生產(chǎn)加工及市場(chǎng)流通等多領(lǐng)域監(jiān)管，有效解決傳統(tǒng)煮散的“辨藥之難”問(wèn)題。本研究以雞血藤為考察對(duì)象，以飲片規(guī)格、含量、指紋圖譜與相似度評(píng)價(jià)及DNA條形碼比對(duì)為考查重點(diǎn)，以期揭示精準(zhǔn)煮散飲片應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)中藥飲片的質(zhì)量均一化，使之實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)和配給的標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化，為中醫(yī)臨床療效提供可靠保障。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器及試劑

美國(guó)Waters2695型高效液相色譜儀系統(tǒng)（Empower 色譜工作站， W2998 DAD檢測(cè)器）；BT125D十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）；粉碎機(jī)（臺(tái)灣榮聰鐵工廠）；2720 Thermal Cycler PCR儀（美國(guó) Applied Biosystems公司）；DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；JY04S-3C型凝膠成像分析系統(tǒng)（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；1-14 小型離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；MX-RL-E型混合儀（大龍興創(chuàng)儀器有限公司）；DP305植物組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；DL 2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；Glodview（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）；Tris-HCl（上海麥克林生化科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：T818979）；Tris（美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：V900483）；β-巰基乙醇（美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：M6250）；瓊脂（美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：V900500）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成，2×Tap PCR Mix酶（北京艾德萊生物科技有限公司）；乙腈、甲酸均為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；超純水由Millipore制得。

1.2 受試藥物

表兒茶素（含量≥98%，生產(chǎn)批號(hào)：110878-200102），購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所；雞血藤市售飲片分別購(gòu)自康美藥業(yè)有限公司（產(chǎn)地：廣西，生產(chǎn)批號(hào)：160811031、160301031）及嶺南中藥飲片有限公司（產(chǎn)地：廣西，生產(chǎn)批號(hào)：160302），經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室黃志海主任中藥師鑒定均為2015版《中國(guó)藥典》（一部）雞血藤項(xiàng)下收載品種。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA 條形碼的建立

取飲片樣本約40 mg，用液氮進(jìn)一步磨碎，采用植物DNA提取試劑盒提取基因組總DNA。ITS2序列擴(kuò)增采用正向引物ITS2F： 5′-ATGCGATACTTGGTG TG AAT-3′，反向引物：ITS3R： 5′-GACGCTTC TCCAGACTACAAT-3′，進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Taq PCR Mix 酶12.5 μL，正向、反向引物各1 μL（2.5 μmol·L-1），模板DNA 2.0 μL（約30-100 ng），加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s（40個(gè)循環(huán)）；72 ℃延伸10 min[10]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將電泳條帶清晰、明亮、單一的PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.2 指紋圖譜檢測(cè)方法

2.2.1 色譜條件的建立

色譜柱：Welch ODS-3 C18（4.6×250 mm，5 μm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（5%→20%）；流速：1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；柱溫：25℃；洗脫時(shí)間：28 min；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取表兒茶素對(duì)照品適量，加甲醇配制成含表兒茶素1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，表兒茶素對(duì)照溶液依次稀釋成80、40、20、10、5及2.5 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于4℃冰箱中保存，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密量取適量飲片提取液，用水稀釋成相當(dāng)于雞血藤飲片0.02 g·mL-1的供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察

按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，考察表兒茶素在上述色譜條件下的線性關(guān)系。

2.3 原飲片與煮散飲片出膏率比較

不同規(guī)格雞血藤煮散飲片制備：取雞血藤飲片（生產(chǎn)批號(hào)：160301301），粉碎后過(guò)篩，得到5-10目（2-4 mm）、10-24目（0.8-2 mm）、24-65目（0.25-0.8 mm）等不同粒徑范圍的煮散飲片。

稱取原飲片及不同粒徑范圍煮散飲片各100 g，采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法[13]進(jìn)行提取。分別加8倍量水，浸泡30 min，煮沸后保持30 min，過(guò)濾，濾渣再加7倍量水煎煮30 min。合并過(guò)濾液，減壓旋蒸至100 mL，即濃縮為相當(dāng)于雞血藤飲片1 g·mL-1的藥液。精密量取25 mL溶液，蒸干，得干浸膏重量，計(jì)算出膏率。

2.4 原飲片與煮散飲片均一性比較

分別取3個(gè)批次雞血藤飲片各200 g，充分混合后，粉碎，過(guò)篩，取10-65目粒徑范圍的煮散飲片。原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片形態(tài)見(jiàn)圖1。不同批次原飲片各取50 g（S1的批號(hào)為160811031，S2的批號(hào)為160301031，S3的批號(hào)為160302）；取10-65目雞血藤煮散飲片，均勻攤平，畫(huà)格分為9份，隨機(jī)選取3份（S4-S6），從每份中分別稱取50 g。

上述6份樣品分別按標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法進(jìn)行提取。合并煎煮液，濃縮成100 mL溶液，即濃縮為0.2 g·mL-1的原藥材溶液。合并提取液，定容至500 mL，即為相當(dāng)于雞血藤飲片0.1 g·mL-1的藥液。精密量取藥液并用水稀釋5倍，采用0.22 μm濾膜過(guò)濾，取10 μL進(jìn)樣。

2.5 數(shù)據(jù)處理

所得序列采用CodonCode Alinger 6.02軟件進(jìn)行校對(duì)拼接，去除序列兩端低質(zhì)量區(qū)。利用軟件MEGA 6.06對(duì)不同樣本序列進(jìn)行比對(duì)，分析ITS2序列特點(diǎn)。以條形碼附加二維碼的方式展示主導(dǎo)單倍型序列特征，左側(cè)部分為DNA序列轉(zhuǎn)換的彩色條形碼圖片，右側(cè)二維碼圖片為QRcode的編碼方式進(jìn)行編碼，掃描可讀取序列信息（圖2）。

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩兩比較時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

HPLC圖譜采用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004 A版），生成指紋圖譜共有模式，計(jì)算樣品的相似度。標(biāo)定共有峰，以表兒茶素為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 ITS2序列分析

應(yīng)用MEGA6.06分析雞血藤3條ITS2序列特征，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)存在2個(gè)變異位點(diǎn)，分別為22位點(diǎn)的G/A突變和83位點(diǎn)的C/T突變，3條雞血藤序列長(zhǎng)度均為207 bp。A、C、G、T的堿基平均含量分別為12.80%、34.54%、35.51%、17.15%，GC含量達(dá)70.53%，主導(dǎo)單倍型序列見(jiàn)圖2。BLAST搜索結(jié)果顯示各樣品相似性最高的為密花豆Spatholobus suberectus與其最相似序列的相似度為100%，表明ITS2序列對(duì)雞血藤藥材可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定。

圖1 雞血藤飲片形態(tài)圖

圖2 雞血藤ITS2條形碼

表1 雞血藤原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片出膏率（±s，n=3）

表1 雞血藤原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片出膏率（±s，n=3）

注：“+++”：澄清度較高，”++”：較為澄清；“-”：未見(jiàn)明顯糊化。

飲片規(guī)格出膏率/%澄清度糊化度原飲片14.01±0.25 +++ -5-10目（2-4 mm）15.53±0.12 +++ -10-24目（0.8-2 mm）15.67±0.15 ++ -24-65目（0.25-0.8 mm）14.63±0.15 ++ -

圖3 表兒茶素對(duì)照品（A）、雞血藤水提液（B）HPLC色譜圖；

表2 原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片提取液中表兒茶素含量（±s，n=3）

表2 原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片提取液中表兒茶素含量（±s，n=3）

組別編號(hào)含量/ mg·g-1x±sRSD/% S1 1.10原飲片提取液S2 1.00 S3 0.89 1.00±0.11 10.54 S4 1.27煮散飲片提取液S5 1.26 S6 1.28 1.27±0.00 0.78

表3 雞血藤指紋圖譜相似度結(jié)果

3.2 原飲片與煮散飲片出膏率比較

出膏率考察結(jié)果表明，與原飲片比較，粉碎后不同粒徑煮散飲片的出膏率均較原飲片有所提高，不同粒徑煮散飲片間出膏率無(wú)顯著性差異（表1）。

3.3 色譜條件考察

將對(duì)照品溶液及供試品溶液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)該色譜條件下表兒茶素分離度良好，對(duì)照品及提取液色譜圖見(jiàn)圖3。以對(duì)照品峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：表兒茶素（286 nm），Y=2774X-2403（R2=0.999 9），表明表兒茶素在2.5-80 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 飲片均一性評(píng)價(jià)

以表兒茶素為考察指標(biāo)，測(cè)定其在原飲片及煮散飲片中的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，混合制成煮散飲片后指標(biāo)成分煎出率有所提高；而其含量均值的RSD值明顯減小，表明飲片質(zhì)量及均一性有所提高。

3.5 指紋圖譜研究

3.5.1 指紋圖譜及相似度評(píng)價(jià)

按照“2.2.1”項(xiàng)下方法，對(duì)雞血藤飲片水提液進(jìn)行指紋圖譜的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。以雞血藤原飲片為參照譜，進(jìn)行自動(dòng)匹配并計(jì)算指紋圖譜相似度，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，在現(xiàn)有的檢測(cè)方法下，原飲片與經(jīng)粉碎混勻得雞血藤煮散飲片樣品共6批樣品的主要色譜峰均可以良好的匹配，相似度分析結(jié)果顯示原飲片的相似度在0.912-1.000之間，而煮散飲片的相似度均在0.977以上，表明雞血藤精準(zhǔn)煮散飲片均一性明顯提高。

3.5.2 指紋圖譜共有峰的標(biāo)定

本研究中以原飲片中表兒茶素（tR=40.765 min）為參考峰，計(jì)算制得精準(zhǔn)煮散飲片與原飲片各共有峰的相對(duì)峰面積（表4）。結(jié)果表明，雞血藤煮散飲片14個(gè)共有峰相對(duì)峰面積略高于原飲片，均一性明顯提高。

4 討論

圖4 雞血藤原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片HPLC指紋圖譜

雞血藤具有活血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止疼、舒筋活絡(luò)的功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、經(jīng)閉、風(fēng)濕痹痛、麻木癱瘓、血虛萎黃等癥。《中國(guó)藥典》對(duì)雞血藤飲片性狀描述為橢圓形、長(zhǎng)矩圓形或不規(guī)則的斜切片，厚3-10 mm。雞血藤煮散飲片為顆粒型飲片，在10-65目之間，藥液過(guò)濾速度適度，澄清度尚可；與原飲片比較，粉碎后不同粒徑煮散飲片的出膏率均有增加；但不同粒徑差異不明顯。比較雞血藤煮散飲片與原飲片指紋圖譜，其共有峰的平均溶出均略有升高，但均一性改善明顯，混合粉碎后的精準(zhǔn)煮散飲片指紋圖譜相似度更佳。

雞血藤為藤莖類飲片，含有大量的木質(zhì)纖維，破碎時(shí)容易出現(xiàn)纖維素與細(xì)粉分離，反而導(dǎo)致精準(zhǔn)煮散飲片含量降低，浸膏提取率降低的現(xiàn)象，所以雞血藤破碎需用剪切式粉碎儀，將雞血藤切割成大小均一的顆粒狀飲片即可。

中藥HPLC指紋圖譜結(jié)合DNA條形碼技術(shù)保證雞血藤物種的正確性及質(zhì)量的可靠性。解決了傳統(tǒng)煮散的“辨藥之難”問(wèn)題，能有效實(shí)現(xiàn)煮散飲片的精準(zhǔn)化鑒定和檢測(cè)，為精準(zhǔn)煮散飲片的應(yīng)用與推廣提供可靠的技術(shù)支持與保障。同時(shí)，發(fā)展精準(zhǔn)煮散飲片能提高中藥藥效物質(zhì)的溶出和保證湯劑煎煮質(zhì)量的穩(wěn)定，從而在保證療效的前提下，可降低藥物使用量，節(jié)約資源，提高中藥資源的合理利用，降低藥品費(fèi)用。

表4 雞血藤共有峰相對(duì)峰面積比較

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A Quality Comparison Between the Precise Powder Decoction Pieces and the Original Slices of Spatholobus suberectus Dunn.

Xu Wen1, Lei Di2, Zhang Jing1, Xu Jiang1, Huang Zhihai1, Qiu Xiaohui1, Julie A. Hawkins2, Chen Shilin3
(1. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine / Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences / China Academy of Chinese Medical Sciences Guangdong Branch, Guangzhou 510006, China; 2. School of Biological Science, University of Reading, Berkshire RG6 6AH, United Kingdom; 3. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

In this study， DNA molecular identification technology and chemical fingerprint method were adopted to evaluate the quality system of precise powder decoction pieces (PPDP) ofS. suberectusdunn (SSD). ITS2 sequence was taken as DNA barcode to indentify SSD. Different specifications of PPDP were prepared， their dry extract contents were quantified in contrast with that of original slices. Three batches of SSD original slices were gleaned and the content uniformity， fingerprint and similarity evaluation before and after the mixing and pulverization were valued by HPLC-DAD. As a result， ITS2 successfully and accurately identified the SSD in this study. The extract rate of PPDP was 15.5%， 1.11 times as much as the original slices. RSD of inter-assay dissolution of cepicatechin from the original slices was 11.0%， which was reduced to 1.0% after mixing and preparing into PPDP. The relative peak area of the 14 common peaks identified by fingerpringts were larger， while the RSD values significantly decreased. It was concluded that the PPDP of SSD improved the extraction efficiency and uniformity of the original slices， featuring quite prospective in more reasonable and scientific clinical use.

Precise powder decoction pieces，Spatholobus suberectusdunn， uniformity， DNA barcode， quality system

10.11842/wst.2017.01.012

R283.3

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-12-23

修回日期：2016-12-23

＊ 廣東省中醫(yī)院專項(xiàng)（2015KT1817）：嶺南中草藥DNA條形碼分子鑒定和生態(tài)適宜性研究，負(fù)責(zé)人：黃志海；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥健康服務(wù)專項(xiàng)（ZZ0908067）：200種嶺南中草藥DNA條形碼研究，負(fù)責(zé)人：黃志海。

＊＊ 徐文、雷迪為共同第一作者。

＊＊＊ 通訊作者：Julie A.Hawkins，主要研究方向：植物分子生物學(xué)；陳士林，本刊執(zhí)行主編，博士，研究員，主要研究方向：生藥分子鑒定研究。