范少平，丁文學，梁碧先

葛根素對HIE新生大鼠神經(jīng)及PI3KAkt信號通路的作用機制研究

范少平，丁文學，梁碧先

目的 觀察葛根素對缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)新生大鼠的神經(jīng)保護作用，分析神經(jīng)保護作用是否涉及PI3K/Akt 信號通路的參與以及可能的機制。方法 90只新生7 日齡Wistar 大鼠隨機分為假手術組(n=10)、HIE 組(n=40)及葛根素療組(n=40)，后兩組又進一步分為3 h、6 h、12 h、24 h 4 個時間點，每個時間點10 只。參照Rice 等和吳婉芳法，建立新生大鼠HIE 模型。HE 染色觀察各組大鼠神經(jīng)元形態(tài)變化，免疫組織化學法檢測磷酸化Akt 的表達。依據(jù)免疫組化的結果采用Western blot 方法進一步檢測PI3K/Akt 信號通路表達。結果 90只Wistar大鼠模型全部成功，全部納入結果分析。HE 染色示葛根素治療組大鼠大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)細胞壞死率較HIE 組明顯減少。免疫組化結果示：隨著時間的延長，葛根素治療組磷酸化Akt 蛋白陽性率較HIE 組顯著上調(diào)(P<0.01)。HIE 組磷酸化Akt 在12 h 時達到高峰，但葛根素治療組在24 h 時達到高峰；在每組每個時間點葛根素組磷酸化Akt 蛋白的陽性表達均高于HIE 組(P<0.01)。假手術組亦有極少量表達。Western blot 結果示：在各個時間點內(nèi)，各組總Akt 的表達一致；但磷酸化Akt 的表達(Ser473 和Thr308)在葛根素治療組明顯強于HIE 組；且隨著時間變化，其表達于上述免疫組化的檢測大致一致。葛根素顯著提高磷酸化Akt 的水平，既可作用于Ser473 磷酸化位點，也可作用于Thr308 磷酸化位點。結論 葛根素對HIE大鼠具有神經(jīng)保護作用。葛根素可激活PI3K/Akt通路來發(fā)揮其對HIE新生大鼠神經(jīng)元的保護作用，其機制可能與上調(diào)磷酸化Akt(Ser473)、磷酸化Akt(Thr308)表達水平，增加Akt磷酸化水平的表達有關。

缺氧缺血性腦??；葛根素；神經(jīng)保護；新生大鼠

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒常見疾病，有著較高的致死率和致殘率，HIE對新生兒生命有著嚴重的威脅，該病癥還會引起新生兒腦癱，癲癇，智力低下，精神運動發(fā)育遲緩停止等嚴重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的疾病。這幾年來，新生兒缺血性腦病的發(fā)病率越來越高，已經(jīng)超過了產(chǎn)傷性顱內(nèi)出血，所以新生兒腦損傷最常見的原因就是缺血性腦病。傳統(tǒng)中藥葛根在我國使用已有幾千年歷史，葛根素是從葛根中分離得到的4，7-二羥基一級8-β-D 葡萄糖異黃酮，它們都是多羥基的黃酮類化合物，分子量比較小，主要在治療心血管疾病方面有較好的效果，其本身活性強、藥理作用強、藥代動力學良好、沒有毒副作用。葛根素能夠對缺血性腦損傷產(chǎn)生保護作用，但是其相關的保護機制還需要進一步的研究分析，接下來主要是研究葛根素怎樣在不同腦缺血中影響腦神經(jīng)細胞的缺血缺氧，還對腦缺血再灌注損傷之后敏感蛋白如何表達有一定的影響。本研究主要是把出生一周的新生大鼠制作成HIE模型，在腹腔注射葛根素，密切觀察葛根素是否能夠治療新生大鼠的HIE，葛根素的影響位點及作用途徑是否涉及PI3K/Akt 信號通路，這也是本次實驗試圖證實之處。以期為葛根素在臨床上治療新生兒HIE 提供可行性實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 動物：SPF級7日齡(以出生日計算為0天)，Wistar大鼠購自我院實驗動物研究中心，雌雄不限，營養(yǎng)中等，體重19 g～21 g，共90只。在模型制備后及觀察階段放回飼養(yǎng)籠，在自然狀態(tài)下由母鼠哺乳喂養(yǎng)，保持適宜的光照，室溫和空氣濕度等。

主要試劑：葛根素購自山東省煙臺魯銀藥業(yè)有限公司。磷酸化Akt 一抗，免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，均購自武漢博士德公司(用于免疫組化)。磷酸化Akt 信號通路試劑盒購自美國NeoMarkers 公司(用于western blot 檢測總Akt、磷酸化AktSer473、磷酸化AktThr308)。鼠抗β-actin單克隆抗體購自sigama公司。硝酸纖維素膜購自Sigama公司。Tris Base、溴酚藍、NP40、Tris-Hcl、脫氧膽酸鈉、SDS、甘氨酸、過磷酸胺、DTT、四甲基乙二胺、TWEEN20購自Sigama公司。甲醇為國產(chǎn)分析純。脫脂奶粉市售。氧氣由我院提供，氮氣購自武漢造船廠，自行配制8%氧氣和92%氮氣混合氣體。其他：乙醚、5%水合氯醛、4%多聚甲醛、眼科剪、組織剪、紗布、絲線、顯微鏡等均由我院實驗動物中心實驗室提供。

儀器和設備：便攜式數(shù)字測氧儀：上海第三分析儀器廠。自制常壓缺氧艙：直徑為40 cm，高60 cm 的圓柱形透明塑料容器，上下各有1個直徑1 cm的小孔與外界相通。UV-754 紫外分光光度計：讓奇(上海)儀器科技有限公司。HQ45 恒溫搖床：金壇市順華儀器有限公司。垂直電泳槽：上海佑偉實業(yè)有限公司。電轉儀：寧波新芝生物科技股份有限公司。Bio-Rad GELDOC-2000 紫外凝膠成像系統(tǒng)。法國Bio-profil圖像分析系統(tǒng)。YJ-875S 超凈工作臺：蘇州佳寶凈化工程設備有限公司。7530-G 型可見紫外分光光度計：費爾伯恩精密儀器(上海)有限公司。低溫離心機(TGL-18R)：上海茸研儀器有限公司。SZ-97 自動三重純水蒸餾器：上?？茣钥茖W儀器有限公司。BS60 三用恒溫水箱：上海善志儀器設備有限公司。AE200 電子天平：上海平軒科學儀器有限公司。HJ-3 磁力攪拌器：金壇市新航儀器廠。300 度恒溫烘箱：北京醫(yī)療設備廠。Gilson 1 000 μL，200 μL，10 μL自動移液器：法國Gilson 公司。低溫高速離心機：上海茸研儀器有限公司。超低溫冰箱：東莞市匯泰機械有限公司。電子天平：AE200 型，拓赫機電科技(上海)有限公司。手提式壓力滅菌消毒器：廣州藍靈水處理設備有限公司。

1.2 實驗方法 動物分組、給藥方式、模型建立和標本采集：健康7日齡Wistar大鼠90只，雌雄不拘，體重(21.0±3.1)g，隨機分為假手術組(n=10)、HIE組(n=40)和葛根素治療組(n=40)。以上3組又隨即分為A、B兩個亞組，并設假手術組為正常對照組。葛根素治療組大鼠于模型制備前一天開始腹腔注射葛根素20 mg/kg，每日兩次，直至標本采集完畢。假手術組和HIE組大鼠同步注射相同劑量生理鹽水。假手術組只把頸部切開同時在左側頸總動脈進行分離術，不需要結扎，將切口縫合之后吸入正?？諝狻IE組和葛根素治療組建立的HIE經(jīng)典模型。HIE組和葛根素組術后3 h、6 h、12 h，24 h 4個時間點各取8只，假手術組于24 h取標本。以上三組然后隨機各自再分為A B兩個亞組。A亞組5%水合氯醛麻醉后，經(jīng)心臟4%多聚甲醛灌注固定，斷頭，頭皮沿前自剪開顱骨，取出大腦，分離左右大腦半球。固定，脫水，透明，包埋后，于前囟前0.3 mm至前囟后0.6 mm之間連續(xù)切片，片厚5 μm，粘于處理的切片上，室溫保存?zhèn)?。其中兩張常?guī)HE染色觀察神經(jīng)元細胞形態(tài)，余留免疫組化檢測磷酸化Akt水平。B亞組直接斷頭取腦，快速剝離腦表面大血管，取左側大腦，液氮凍存，以備western blot實驗檢測總Akt、磷酸化Akt(Ser473和Thr308)表達水平。

免疫組織化學染色步驟：利用二甲苯和酒精進行標本脫蠟處理，使用過氧化酶(3%)進行孵育5 min，目的是消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。接下來需要把玻片放到枸櫞酸緩沖液的容器中，放到微波爐中維持在92℃～98℃加熱10 min，將抗原修復，取出之后在室溫環(huán)境中冷卻10 min。滴加磷酸化一抗Akt (1∶200稀釋)同時被生物素標記的第二抗體，放置在37 ℃環(huán)境中孵育半小時。隨后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素三抗(普通型SP試劑盒，1∶ 100稀釋)，放置環(huán)境如上。最后需要滴加新鮮的DAB溶液，觀察有沒有顯色反應，如果細胞出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀則為陽性反應，利用顯微鏡控制反應時間，上述處理完成之后還需要用蒸餾水進行洗滌，等到干燥之后用中性樹膠封好固定。以上各步驟之間均以0.01 mol/ LPBS ( pH7.4 )漂洗5 min×3次。假手術對照組以0.01 mol/LPBS代替磷酸化Akt抗血清。

Western blot：提取保存新鮮組織中的100 mg蛋白組織放到勻漿機，然后取50 mL Tris-HCI，150 mLNaCl，1 μg/μL的1%脫氧膽酸鈉，1 μg/μL的1%NP-40，1 μg/μL的1%SDS，1 μg/μLlAprotinin、Leuptin、Pepstalin 配制成裂解液后攪拌均勻。放置到轉速13 000 r/min裝置中離心10 min。然后，把上清液放到Ep管中，蛋白定量，并描繪出標準的蛋白曲線。然后進行圖像分析；隨后通過吸光度值對磷酸化的Akt進行蛋白量的調(diào)整，目的是讓每對組織中的蛋白量都相同，還要利用相似的方法對磷酸化Akt(Ser473、Thr308)行western blot 檢測(方法同上)，目的是找到調(diào)整后每對組織磷酸化Akt表達的差異。最后要把樣本中的Akt的積分光密度值和β-actin 的積分光密度值進行比較，同時把磷酸化Akt 積分光密度值和調(diào)平后Akt 的積分光密度值比較，得出蛋白質的含量。

2 結 果

2.1 各組HIE大鼠腦組織的病理表現(xiàn) HE染色顯示假手術組皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元結構完整，細胞排列整齊，形態(tài)正常，分布均勻，無明顯神經(jīng)元損傷表現(xiàn)。在3 h、6 h、12 h、24 h這四個時間點內(nèi)，隨著時間推移，HIE組皮層和海馬區(qū)可見大量神經(jīng)元的壞死，排列紊亂，結構不清，細胞體積縮小，胞核固縮，染色加深，形狀不規(guī)則，甚至胞膜破裂，細胞解體消失；而葛根素治療組可看到部分的神經(jīng)細胞的壞死，形狀不規(guī)則，核固縮，染色加深，腦組織結構及細胞層次清楚，皮層和海馬區(qū)未見明顯細胞丟失(見圖1)。

圖1 各組HIE大鼠腦組織的病理表現(xiàn)

2.2 葛根素對HIE大鼠皮層和海馬組織中磷酸化Akt表達的影響 磷酸化Akt陽性細胞主要為胞漿著色，呈棕黃色。免疫組化的結果顯示各組磷酸化Akt的表達詳見表1、圖2。假手術組亦有極少量表達；HIE組的陽性細胞數(shù)隨時間延長而增多，在12 h達到高峰；葛根素治療組的陽性細胞時間延長而增多，但在24 h時達到高峰。葛根素對HIE大鼠皮層和海馬組織中磷酸化Akt表達的影響。

表1 葛根素對皮層和海馬組織中磷酸化Akt 表達的影響

圖2 葛根素對皮層和海馬組織中磷酸化Akt 表達的影響

2.3 Western blot檢測總Akt，磷酸化Akt(Ser473、Thr308)表達的變化 造模后3 h，6 h，12 h，24 h 四個時間點HIE組與葛根素治療組相比較總Akt的表達一致；磷酸化Akt(Thr308 和Ser473)的表達在葛根素治療組明顯高于HIE組。且葛根素治療組磷酸化Akt的表達隨著損傷后時間的延長而升高，在24 h到達高峰；HIE組Akt的表達在12 h達到高峰。詳見表2、圖3。

組別 Ser473 3h6h12h24h Thr308 3h6h12h24hHIE組45.89±4.2173.59±7.05119.57±10.2843.26±4.0828.26±2.5462.54±5.68107.63±9.2527.59±2.39葛根素組49.67±4.6489.68±8.45168.24±15.21204.65±18.2240.28±3.5678.64±7.23147.89±12.35182.64±15.32

圖3 western blot 檢測總Akt，磷酸化Akt(Ser473、Thr308)表達的變化

3 討 論

對于新生兒缺氧缺血性腦病的發(fā)病機制和治療方法的研究，由于受到多種因素的制約，目前大多采用HIE 動物模型進行研究。對于人類來說，腦發(fā)育的高峰期是在出生時候，而新生一周的大鼠和新生兒出生時的腦發(fā)育處于相同的階段。該實驗研究對象是新生一周的大鼠，并成功建立新生兒HIE模型。腦缺氧缺血所致的病理損害由復雜的綜合因素引起。研究證明，HIE的腦損傷神經(jīng)元壞死包括缺氧缺血后的即刻腦死亡(腦細胞壞死)和延遲性腦損傷(以細胞凋亡為主)兩個階段[1-3]。腦細胞壞死階段，因為能量的損耗嚴重，離子平衡失調(diào)，細胞中的鈉離子和鈣離子不斷聚集，同時興奮性氨基酸、氧自由基和NO不斷地增加，最終造成細胞溶解死亡，此過程稱為神經(jīng)元壞死。神經(jīng)元壞死的第二階段也稱為遲發(fā)型神經(jīng)元壞死，一般發(fā)生在幾小時之后，主要是由局部環(huán)境的刺激引起的，容易受到基因的調(diào)控發(fā)生非炎癥性死亡。腦神經(jīng)細胞的凋亡和HIE新生動物遲發(fā)型神經(jīng)損傷具有非常緊密的聯(lián)系。

腦缺血和細胞凋亡相關的信號轉導通路主要包括下面幾種酶物質：有絲分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3kinase，PI3-K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase，Akt)信號通路。隨著醫(yī)學的發(fā)展，人們研究的不斷進步，研究發(fā)現(xiàn)，在細胞凋亡過程中，MAPK信號通路具備雙重功能，然而，PI3K/AKT信號通路依舊是重要的細胞存活信號通路，大多數(shù)神經(jīng)營養(yǎng)因子會激活PI3K/Akt信號通路，然后對細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，并發(fā)揮神經(jīng)保護作用。PI3K屬于磷脂?；技っ福せ钪竽軌蚴辜毎ど系募〈及l(fā)生磷酸化，生成一系列的相關物質，如磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI-3P)、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸(PI-3，4-P2)和磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PI-3，4，5-P3 )。后兩種物質可以和Akt的PH區(qū)結合，使得一部分Akt被激活，同時使Akt轉位于細胞膜的內(nèi)表面。5-磷酸酶能夠把磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸轉化為PI-3和4-P2，進而能夠使位于細胞膜內(nèi)的磷脂酰激酶依賴激酶1(phosphatidylinositol dependent kinase，PDK1)和磷脂酰激酶依賴激酶2(PDK2)激活，同時這兩種酶又可以把Akt激活。Akt屬于重要的抵抗凋亡的調(diào)節(jié)因子，能夠介導生物學效應[3]。PI3K被激活后，可以合成磷脂物質，進而使得Akt和下游的信號級聯(lián)反應被全部激活，對細胞的生存、生長發(fā)育以及分化增殖產(chǎn)生一定的影響[4]。因此Akt磷酸化可以作為衡量PI3K活性的指標許多研究表明，PI3K/Akt信號通路與腦缺血損傷有關。有學者研究大鼠大腦中動脈閉塞90 min后磷酸化Akt和磷酸化ERK在神經(jīng)元中的表達，通過采取免疫熒光方法后得到結果，對照組中磷酸化Akt陽性細胞弱表達，而模型組在缺血再灌注1 h～3 h表達上高，1 h達到高峰，而且缺血周圍區(qū)要遠遠多于中央?yún)^(qū)[5]。磷酸化的ERK單陽性細胞核Akt/ERK雙陽性細胞在一小時后也達到高峰。由此可知，缺血再灌注早期Akt和ERK信號通路都在腦缺血誘發(fā)的應激反應中發(fā)揮作用，同時這兩種物質是共同發(fā)揮作用的。還有學者通過進行體外細胞培養(yǎng)，對缺血條件下星形膠質細胞的凋亡和磷酸化Akt和ERK之間的關系進行研究[6]，其結果發(fā)現(xiàn)，TUNEL陽性細胞在缺血后6 h開始出現(xiàn)，12 h呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，但是磷酸化Akt和ERK都是在缺血后6 h～12 h表達增加，由此可說明磷酸化Akt和ERK都和缺血誘導的細胞凋亡具有一定的聯(lián)系。但是還有部分研究認為Akt參與了缺血的預適應，能夠對腦缺血神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用，而且其激活程度和腦缺血的損傷程度有密切的聯(lián)系。缺血預適應主要功能是確保嚴重缺血情況下神經(jīng)細胞的死亡，可以保護嚴重缺血條件下的神經(jīng)細胞死亡[7]。

葛根素主要是從中藥豆科植物中提取出來的，干燥根是其主要的成分，其化學名稱是4，7-二羥基和8-β-D葡萄糖異黃酮。目前研究表明，葛根素可擴張腦血管，增加腦血流量和降低腦組織氧耗量，對血管內(nèi)皮細胞進行調(diào)節(jié)，具有抗氧化、清除自由基以及抑制缺血再灌注損傷的作用[8-9]；葛根素對細胞凋亡具有干預作用，這說明細胞凋亡屬于葛根素發(fā)揮保護效應的分子機制?，F(xiàn)在已經(jīng)有大量研究表明，葛根素的作用主要和Bcl家族因子有關，比如P53，fas，fos等，除此之外還和caspase-3信號傳遞途徑有關。細胞凋亡的過程是非常復雜的，葛根素的影響位點以及作用途徑都和其他的基因和調(diào)控因子有關聯(lián)。這些問題對于相關疾病的預防以及治療具有非常重要的意義[10]。本次實驗研究的結果顯示，在病理切片的HE染色皮層和海馬區(qū)內(nèi)可明顯看到葛根素治療組神經(jīng)壞死程度較HIE組輕，腦組織的空隙中空泡逐漸減少，并出現(xiàn)核邊集，固縮及染色體片段的神經(jīng)元比HIE組少。通過免疫組化檢測方法可以發(fā)現(xiàn)：單純HIE組磷酸化Akt表達在損傷3 h后會隨著時間的延長逐漸減少，在24 h后達到低谷。但是隨著再灌注時間的延長，葛根素治療組磷酸化Akt的表達會呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，并在24 h達到高峰，同時還會發(fā)現(xiàn)12 h和24 h會出現(xiàn)明顯上升。這表明葛根素能保護HIE損傷過程中大鼠海馬神經(jīng)元，磷酸化Akt的表達上調(diào)可能是其重要的機制之一。為進一步證實葛根素的作用涉及PI3K/Akt途徑，用western blot方法檢測PI3K通路下游關鍵性激酶Akt(總Akt、磷酸化Akt Ser473，磷酸化Akt Thr308)的表達情況 ?？偟腁kt表達在葛根素治療組及HIE組之間無明顯差別，但磷酸化Akt的表達在葛根素治療組明顯強于HIE組。葛根素顯著提高磷酸化Akt的水平，既可作用于Ser473磷酸化位點，也可作用于Thr308磷酸化位點。故葛根素可激活PI3K/Akt通路來發(fā)揮其對HIE新生大鼠神經(jīng)元的保護作用。

本次實驗發(fā)現(xiàn)，葛根素對HIE 模型新生大鼠具有神經(jīng)保護作用，可通過激活PI3K/Akt 通路來發(fā)揮其對HIE 新生大鼠神經(jīng)元的保護作用。其機制可能與上調(diào)磷酸化Akt(Ser473)、磷酸化Akt(Thr308)表達水平，增加Akt 磷酸化水平的表達有關。加之已有的研究結果，葛根素可明顯減輕HIE 神經(jīng)元死亡，是一種較好的有廣闊應用前景的神經(jīng)保護劑。

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(本文編輯王雅潔)

Study on the Mechanism of Puerarin on Neurons and PI3K/Akt Signaling Pathway in Neonatal Rats with Hypoxic-ischemic Encephalopathy

Fan Shaoping，Ding Wenxue，Liang Bixian

People’s Hospital of Longhua District，Southern Medical University，Shenzhen 518109，Guangdong，China

Objective To observe the neuroprotective effect of puerarin in hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) rats model， and to investigate whether the PI3K/Akt signal pathway was involved in the neuroprotective effect of puerarin on neonate rat in HIE model and its possible mechanisms.Methods Ninety 7-day neonatal Wistar rats were randomly divided into sham operation group (n=10)， HIE group (n=40) and puerarin treatment group (n=40).The last two group were further divided into 3 h，6 h，12 h and 24 h four time points， each of them had 10 rats.Rats model of HIE were established according to Rice's and Wu Wanfang's method， then HE stain was used to observe the morphological change， immunohistochemical method and western blot were used to detect the changes of PI3K/Akt pathway， including the expression level of total Akt， phosphorylated Akt(Ser473 and Thr308)in brains of rats.Results The HIE rats model had been established successfully and 90 Wistar rats were take into the results analysis.Compared with HIE group， HE result showed that the necrotic neurons in cortical layer and hippocampus were significantly reduced in puerarin treatment group.The immunohistochemical result proved that the expression of phosphorylated Akt in puerarin treatment group was apparently increased with time going by(P<0.01).Phosphorylated Akt reached its peak after 12 h in HIE group while after 24 h in puerarin treatment group， and the expression of phosphorylated Akt in puerarin treated group was higher than that in HIE group in every time point (P<0.01).There was extremely small amount expression in sham operation group.Western blot showed that the expression level of total Akt was at equal pace between three groups in every time point.Compared with HIE group，the phosphorylated Akt (Ser473 and Thr308) level was increased significantly in puerarin treatment group， what's more， with time going by， the change of expression roughly conformed to the immunohistochemical result above.Puerarin could increase the levels of phosphorylated Akt by playing role on Ser473 phosphorylation site as well as Thr308 phosphorylation site.Conclusion Puerarin has neuroprotective effect on HIE rats model by activating the PI3K/Akt signal pathway.Its mechanism may be related to the up-regulation of phosphorylated Akt (Ser473 and Thr308) expression， and increased the expression of Akt phosphorylation

hypoxic-ischemic encephalopathy;puerarin;neuroprotecton；neonatal rat

國家自然科學基金(No.81370449)，項目名稱：腦缺血后lncRNA調(diào)控神經(jīng)元生存的機制研究

南方醫(yī)科大學附屬深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院(深圳 518109)，E-mail：szfanshaoping@163.com

引用信息：范少平，丁文學，梁碧先.葛根素對HIE新生大鼠神經(jīng)及PI3KAkt信號通路的作用機制研究[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(6)：680-685.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.012

1672-1349(2017)06-0680-06

2016-08-15)