李毓新

脊髓損傷大鼠遠端神經(jīng)元及骨骼肌變化的實驗研究

李毓新

目的 探討脊髓損傷大鼠遠端神經(jīng)元及骨骼肌變化情況，以期為臨床上治療提供有效依據(jù)。方法 選取30只大鼠為研究對象，每組10只，分別為對照組、 手術組和脊髓損傷組。對照組為正常大鼠，手術組行椎板切除術，脊髓損傷組行胸10完全脊髓損傷。在制成模型后1周、2周、4周、12周、24周觀察大鼠坐骨神經(jīng)-運動終板-內側腓腸肌形態(tài)變化情況。結果 脊髓損傷電鏡下坐骨神經(jīng)術后12周有髓神經(jīng)纖維髓鞘崩解，崩解髓鞘板層清晰，術后24周有髓神經(jīng)纖維髓鞘已模糊、碎裂髓鞘增多，薄髓和無髓神經(jīng)纖維12周后增多；腓腸肌光鏡下術后12周局部肌細胞邊界清楚，多數(shù)模糊，肌細胞核相對聚集，結締組織增生明顯；術后24周肌細胞融合，細胞核密集，融合細胞間見有空隙，結締組織增生明顯；電鏡下運動終板術后12周突觸皺褶和突觸前后膜不可辨，突觸結構紊亂，肌纖維明暗帶清晰，z線不連續(xù)，高倍鏡下突觸皺褶未見，突觸前后膜不可辨，可見類圓形突觸小泡和細小顆粒，肌板結構清晰。結論 大鼠脊髓損傷后在損傷平面以下周圍神經(jīng)、運動終板、骨骼肌在形態(tài)上會發(fā)生規(guī)律性變化，12周后顯著變化，24周后則毀損性改變。

脊髓損傷；遠端神經(jīng)元；骨骼肌變化；大鼠

脊髓損傷是臨床上治療較為棘手疾病，治療目的是恢復損傷平面以下運動和排泄功能。但這依賴于脊髓傳導性、腦和周圍神經(jīng)肌肉保持良好功能，三者只有統(tǒng)一協(xié)調才能恢復滿意。若遠端神經(jīng)或肌肉不可逆損傷則脊髓傳導恢復幾乎不可能。有研究稱，切斷胸12脊髓制造完全性截癱動物模型，在傷后3周、6周切除下肢全部神經(jīng)干，病理檢查發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維、髓鞘等無明顯變化[1]。也有研究認為，在大鼠胸10完全脊髓橫斷損傷后，光鏡和電鏡觀察腓總神經(jīng)形態(tài)學變化，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后腓總神經(jīng)髓鞘和軸索會出現(xiàn)明顯退變，且退變隨時間推移而逐漸加重，會出現(xiàn)軸索發(fā)芽現(xiàn)象[2]。故大鼠完全橫斷脊髓損傷后會造成損傷平面以下周圍神經(jīng)發(fā)生跨神經(jīng)元變性。本研究觀察脊髓損傷后損傷平面以下神經(jīng)、肌肉、運動終板在自然病程中形態(tài)學變化，為脊髓損傷臨床診治提供有效時間窗。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選取30只大鼠，分為對照組、手術組和脊髓損傷組，每組10只。近交系，均為雄性，體重(200±10)g，由北京試驗動物中心提供。

1.2 動物模型制備 大鼠術前禁食12 h，稱體重后采取10%水合氯醛(3～4)mL/kg腹腔內注射麻醉，俯臥在手術臺上，備皮消毒后以胸10棘突為中心行背側正中切口，長約3 cm，緊貼棘突骨面縱向分離椎旁肌肉和軟組織，顯露出胸9～11椎板和棘突，咬除胸9～11棘突和移除胸10椎板，顯露胸10水平脊髓，并用剪刀迅速橫斷胸10脊髓，在脊髓斷端頭側切除2 mm脊髓組織，移除后在脊髓端置入明膠海綿。逐層縫合，在試驗期間人工排尿2～3次每日，直至恢復正常排尿為止。手術組則僅行棘突和椎板切除，不損傷脊髓。

1.3 取材 以體積分數(shù)10%水合氯醛麻醉后從左心室插管后剪開右心耳，灌注生理鹽水沖洗待液體清亮后用40 g/L多聚圈經(jīng)心臟緩慢灌注，結束后取右側坐骨神經(jīng)1 cm，腓腸肌肌腹中部神經(jīng)入肌處取0.8 cm肌肉和小腿內側腓腸肌肌腹1 cm，固定12 h后進行處理，石蠟打包后將內側腓腸肌標本進行連續(xù)橫向切片，厚度為10 μm，進行蘇木精-伊紅染色，將坐骨神經(jīng)和運動終板行半薄切片后在光鏡下進行定位，超薄切片后行電子染色進行透視電鏡觀察。觀察電鏡下坐骨神經(jīng)和內側腓腸肌運動終板情況，光鏡下觀察內側腓腸肌情況。

2 結 果

2.1 電鏡下脊髓損傷觀察結果 對照組有髓神經(jīng)纖維、無髓神經(jīng)纖維一直存在，髓鞘外形正常。手術組有髓神經(jīng)纖維外形正常。脊髓損傷則出現(xiàn)規(guī)律性變化，表現(xiàn)為術后2周有髓神經(jīng)纖維髓鞘正常，術后4周有髓神經(jīng)纖維崩解、板層分離，有髓神經(jīng)纖維和無髓神經(jīng)纖維。術后12周有髓神經(jīng)纖維崩解增多、碎裂、崩解髓鞘板層清晰，新生神經(jīng)纖維髓鞘細壁薄，無髓神經(jīng)纖維增多，術后12周有髓神經(jīng)纖維髓鞘崩解，崩解髓鞘板層清晰，術后24周有髓神經(jīng)纖維髓鞘已模糊、碎裂髓鞘增多，薄髓和無髓神經(jīng)纖維12周后增多。 詳見圖1。

注：A和B為術后2周表現(xiàn)，C和D為脊髓損傷術后4周表現(xiàn)，E和F為脊髓損傷后12周變化；G和H為脊髓損傷24周所見。

圖1 電鏡下脊髓損傷觀察結果

2.2 腓腸肌光鏡下觀察結果 對照組細胞肌束膜和肌內膜邊界清楚，肌細胞核位于肌膜下方。手術組術后2周肌細胞肌束和肌內膜邊界清楚，脊髓損傷術后2周肌細胞結細胞略縮小，術后4周肌細胞截面積縮小，局部肌細胞破壞明顯，術后12周局部肌細胞邊界清楚，多數(shù)模糊，肌細胞核相對聚集，結締組織增生明顯；術后24周肌細胞融合，細胞核密集，融合細胞間見有空隙，結締組織增生明顯。詳見圖2。

注：A為對照組肌細胞，B為手術組術后2周肌細胞，C，D，E，F(xiàn)為脊髓損傷術后2周、4周、12周、24周肌細胞截面積和組織變化，脊髓損傷術后24周肌細胞融合，細胞核密集，融合細胞間間隙不一，結締組織增生明顯。

圖2 腓腸肌光鏡下觀察結果

2.3 電鏡下運動終板觀察結果 脊髓損傷術后4周突觸皺褶結構清晰，突觸內可見細顆粒狀物質，高倍鏡下觀察可見突觸前后膜清晰，突觸間隙、皺褶清晰，各個結構內見細小顆粒，術后12周突觸皺褶和前后膜清晰，突觸內可見細小顆粒，肌纖維明暗可見，z線不連續(xù)。高倍鏡下突觸皺褶清晰，突觸前后膜層次分明，結構內可見細小顆粒，肌板清晰；術后12周突觸皺褶和突觸前后膜不可辨，突觸結構紊亂，肌纖維明暗帶清晰，z線不連續(xù)，高倍鏡下突觸皺褶未見，突觸前后膜不可辨，可見類圓形突觸小泡和細小顆粒，肌板結構清晰。詳見圖3。

注：A為術后4周橫截面(1萬倍)，B為術后4周橫截面(4萬倍)，C為術后12周縱切面(4萬倍)，D為術后12周縱切面(4萬倍)，E為術后12周縱切面(5千倍)，F(xiàn)為術后12周縱切面(4萬倍)，術后12周突觸皺褶和突觸前后可辨，可見細小顆粒，肌纖維明、暗帶清晰，z線不連續(xù)，同時突觸皺褶隱約可見突觸內顆粒，突觸前結構紊亂，肌纖維清晰，z線不連續(xù)。

圖3 電鏡下運動終板觀察結果

3 討 論

大鼠脊髓橫斷性損傷4周后坐骨神經(jīng)出現(xiàn)有髓神經(jīng)纖維髓鞘退變，且會隨著時間推移而變化，12周后髓鞘出現(xiàn)崩解碎解現(xiàn)象，伴隨有新生薄髓和大量無髓神經(jīng)纖維，24周后最明顯，髓鞘破裂最明顯，髓鞘結構層模糊不清。這和手術、正常大鼠比較有明顯不同，這可推測出脊髓損傷后遠端神經(jīng)元發(fā)出軸突構成周圍神經(jīng)發(fā)生退變，且會隨著時間進行性加重。結合相關報道[3]，是因為存在跨神經(jīng)元變性。脊髓損傷后發(fā)生跨神經(jīng)元變性時間窗為20周左右。另外，動物模型不同如挫傷模型、壓迫模型、缺血損傷模型、橫斷模型，同一實驗動物不同脊髓損傷模型對損傷結構和運動功能影響不同[4-5]。

在運動終板形態(tài)上，脊髓橫斷性損傷4周后內側腓腸肌運動終板結構完整，突觸皺褶清晰，12周退變和完整運動終板均存在，但24周后則無法找到運動終板，這說明完全性脊髓損傷病程中，隨著觀察時間延長，運動終板結構會出現(xiàn)不可逆退變性變化；這和有些報道結果類似[6-7]，脊髓橫斷損傷后運動終板著色，數(shù)量上和正常無明顯變化，脊髓損傷4周后肌纖維運動終板出現(xiàn)退變，終板染色變淺，軸索終末減少，終板核減少，肌漿淡染，終板邊緣皺縮，中央出現(xiàn)空泡樣淡然區(qū)。脊髓損傷8周后運動終板會出現(xiàn)明顯退變，染色區(qū)空白。免疫組織化學技術證實橫斷性脊髓損傷大鼠后肢神經(jīng)肌肉接頭發(fā)生解剖學不穩(wěn)，突觸前后結構減少和軸突終末芽生，神經(jīng)肌肉突觸出現(xiàn)選擇性分解[8-9]。

在腓腸肌形態(tài)變化上，結果顯示，脊髓損傷4周后腓腸肌肌細胞截面積縮小，且截面積和觀察時間呈負相關。12周肌細胞萎縮明顯，大量結締組織增生，24周后肌細胞大片融合，無法確認肌細胞結構，且結締組織增生明顯，而手術組和正常組則無此變化。推測脊髓損傷后肌細胞會發(fā)生進行性蛻變，肌細胞截面積縮小，后期表現(xiàn)為一些肌纖維形態(tài)結構破壞和結締組織填充[10-11]。這和報道結果類似[12-13]，脊髓損傷后大鼠肌纖維數(shù)目減少[14]，肌纖維萎縮，表現(xiàn)為肌肉截面積縮小，肌肉質量下降，肌間脂肪堆積。 大鼠比目魚肌和內側腓腸肌在脊髓損傷后1周下降22%和27%[15]。脊髓損傷后3周下降15%和18%，脊髓損傷10周和脊髓損傷3周在肌肉濕重量上相近。

大鼠在完全性橫斷性脊髓損傷自然病程中損傷平面以下周圍神經(jīng)、運動終板和骨骼肌在形態(tài)上會發(fā)生規(guī)律性變化，12周會發(fā)生顯著改變，24周后則出現(xiàn)不可逆損傷。

本研究中存在缺陷有，未將神經(jīng)電生理學相關評價標準納入，這樣就不能從量化程度上反應神經(jīng)肌肉運動功能變化情況。但大鼠脊髓損傷和人脊髓損傷在運動神經(jīng)元和骨骼肌上有一定相近性，對治療時間窗有一定的作用。

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(本文編輯王雅潔)

西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院(西安 710000)，E-mail：liyuxinyxtg@163.com

引用信息：李毓新.脊髓損傷大鼠遠端神經(jīng)元及骨骼肌變化的實驗研究[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(6)：686-688.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.013

1672-1349(2017)06-0686-04

2016-08-30)