郭淼，張曉鶯，李燕云

(新疆生產建設兵團醫(yī)院，烏魯木齊830002)

中腦神經損傷可引起滑車神經以及動眼神經等方面的疾患。一定數量神經細胞的存活是受損中腦神經細胞修復的基礎。神經再生是神經發(fā)育過程的再現(xiàn)，因此對神經細胞生長發(fā)育過程的研究有助于探討損傷修復的機制，從而為神經損傷的治療提供依據。銀杏內酯B(GB)是銀杏葉提取物中的重要成分，目前已用于腦缺血、老年癡呆癥、心血管疾病及哮喘等疾病的治療[4]。海人藻酸(KA)是類似于谷氨酸的一種興奮性神經毒素，在體內外實驗中常被作為引起細胞死亡的經典細胞損傷模型藥物。目前，對GB治療中腦神經損傷的作用尚不明確。 2015年3月～2016年1月，我們應用KA制備大鼠胚胎中腦神經細胞損傷模型，觀察GB對細胞存活以及生長的影響，探討GB對大鼠中腦神經細胞損傷的保護作用及其機制，為GB在神經損傷修復治療中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 健康成年雌雄Wistar大鼠各30只，體質量250 g左右，63～70日齡，由中山大學動物實驗中心提供。GB、KA、MTT(美國Sigma公司)；胰蛋白酶(1∶250)、HEPES及高糖DMEM干粉培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；微量加樣器(法國Gilson公司)；酶標儀(美國Bio-Rad公司)；臺式低速離心機TDL-5C(上海菲恰爾分析儀器有限公司)。

1.2 大鼠胚胎中腦神經細胞培養(yǎng)及鑒定 大鼠雌、雄鼠合籠受孕，取30只受孕15 d的孕鼠，脫頸處死后，放入盛有75%乙醇容器內，消毒5 min，于無菌條件下取出胚胎放置于培養(yǎng)基中，取出胚胎中腦組織，用PBS溶液將血污清洗干凈，剪碎腦組織，置于37 ℃、濃度為0.25%的Trypsin溶液中浸泡5 min進行消化，之后將消化液吸除，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，將沉淀吹打后制作為單神經細胞懸液[6]。使用臺盼藍進行細胞計數，調整細胞密度為4×108/mL的細胞懸液，接種在涂有10 mg/L的Poly-L-Lysine培養(yǎng)板上，在溫度37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后待細胞貼壁后，全量換液1次。以后每2～3天半量換液。采用神經元特異性免疫組化染色(NSE)鑒定原代培養(yǎng)的神經細胞[8]，經鑒定神經細胞的細胞質呈棕黃色顆粒，即為NSE陽性，中腦神經細胞培養(yǎng)成功。

1.3 細胞分組及干預方法 中腦神經細胞密度調整為4×106/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加50 μL細胞懸液。24 h后，待細胞貼壁，分為對照組、神經生長因子(NGF)組(NGF組)、GB組、KA組、NGF+KA組、GB+KA組。對照組僅在培養(yǎng)基中培養(yǎng)；NGF組在培養(yǎng)基中加入50 mg/L NGF；GB組在培養(yǎng)基中加入50 mg/L GB；KA組在培養(yǎng)基中加入100 μmol/L KA；NGF+KA組在培養(yǎng)基中加入50 mg/L NGF及100 μmol/L KA；GB+KA組在培養(yǎng)基中加入50 mg/L GB及100 μmol/L KA。每組分為6個復孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。

1.4 細胞存活率測定 采用MTT法。對各組細胞培養(yǎng)后每隔4 h對每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用移液器移除上清液。每孔加入DMSO 150 μL，置于振蕩器振蕩15 min后，用酶標儀(490 nm波長)在各孔測得A值，即為細胞存活率。

1.5 集落分化率測定 采用Giemsa染色法。各組分為10孔，培養(yǎng)10 d后，對中腦神經細胞集落進行計數。以胞體飽滿呈圓形或橢圓形，光暈明顯，突起均勻光滑的細胞認為是活細胞；以胞體腫脹或皺縮，形態(tài)不規(guī)則，空泡化，突起斷裂呈串珠樣甚至消失認為是細胞受損或死亡。細胞用4%甲醛固定，再放入37 ℃培養(yǎng)箱內孵育過夜，次晨沖洗2次，Giemsa染色，經Leica采集圖像觀察染成藍色的胚胎中腦神經細胞集落，計數集落數，以對照組集落數為100%，計算中腦神經細胞集落分化率。

2 結果

2.1 各組細胞存活率比較 對照組在24、48、72、96 h時細胞存活率無明顯變化。KA組在48、72、96 h時細胞存活率均低于對照組(P均<0.05)；NGF+KA組、GB+KA組在48、72、96 h時，細胞存活率均高于KA組(P均<0.05)；NGF組、GB組在72、96 h時，細胞存活率均高于對照組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組中腦神經細胞集落分化率比較 對照組、NGF組、GB組、KA組、NGF+KA組、GB+KA組集落分化率分別為100%、131%、134%、29.5%、29.5%、86.1%、82.1%，NGF組、GB組集落分化率均高于對照組(P均<0.05)，KA組、NGF+KA組、GB+KA組集落分化率均低于對照組(P均<0.05)，NGF+KA組、GB+KA組集落分化率均高于KA組(P均<0.05)。

表1 各組細胞存活率比較

注：與同時點對照組比較，*P<0.05；與同時點KA組比較，△P<0.05；與同組24 h時比較，#P<0.05。

3 討論

神經再生是神經發(fā)育過程的重演，受多種機制所調控[9～11]。對神經細胞生長發(fā)育過程的研究有助于探討損傷修復的機制，從而為神經損傷的治療提供依據。神經營養(yǎng)因子如NGF、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)可以促進損傷大鼠中腦神經細胞突起的生長，有助于中腦神經細胞的功能恢復。但是，這些神經營養(yǎng)因子通過血腦屏障的能力較弱，不良反應較多[1～3]。因此，尋找可以透過血腦屏障同時有神經保護作用的小分子物質，是目前防治中腦損傷研究的一個新思路。

銀杏葉提取物的活性成分主要是黃酮、內酯，目前已分離出銀杏內酯A、B、C、J、M及白果內酯等五種內酯[15]。其中，GB是銀杏葉提取物中的重要成分，也是血小板活化因子受體的天然拮抗劑，其特異性抗血小板活化因子的作用最強。據報道，GB可保護細胞膜的穩(wěn)定性，顯著降低大腦皮層細胞乳酸脫氫酶釋放；減少亞硝酸根離子形成的毒性，降低丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，導致NO的毒性減弱，對自由基對細胞膜和線粒體損傷引起的神經細胞損傷具有拮抗作用；改善新陳代謝；提高細胞膜通透性；使細胞內環(huán)境得以良性循環(huán)。與此同時，GB能減輕KA誘導的神經細胞內鈣離子的超載，進而對神經細胞起保護作用[16,17]。目前，GB制劑主要用于心血管疾病、腦缺血、腦老化、老年癡呆癥及哮喘病的治療。但GB對腦細胞的影響作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，NGF+KA組、GB+KA組細胞存活率均高于對照組，表明GB和NGF均能改善由KA誘導的胚胎中腦神經元損傷。本研究結果顯示，NGF組、GB組在72、96 h時細胞存活率均高于對照組，提示GB在72 h后能夠明顯促進大鼠胚胎中腦神經細胞的生長，并且對大鼠胚胎中腦神經細胞的生長起保護作用，具有與NGF相同的功能。

細胞集落表示細胞獨立生存能力，細胞對培養(yǎng)環(huán)境有較大的適應性和具有較強的獨立生存能力時，細胞集落率高。本研究發(fā)現(xiàn)， NGF+KA組、GB+KA組集落分化率高于KA組，提示GB能促進胚胎大鼠中腦神經細胞的生長與分化， 其保護中腦神經細胞的作用與NGF相似。

綜上所述，GB能有效對抗KA對大鼠中腦神經細胞的毒性作用，其作用機制可能與GB促進中腦神經細胞的生長與分化有關。