別立莉，梁會濤，安慧娟

(河南省紅十字血液中心，河南鄭州450012)

抗體放散試驗在直接抗人球蛋白試驗陽性患者中的應用

別立莉，梁會濤，安慧娟

(河南省紅十字血液中心，河南鄭州450012)

目的探討抗體放散試驗在直接抗人球蛋白試驗（DAT）陽性患者輸血前實驗室檢查中的意義，為臨床輸血安全提供保障。方法通過回顧性分析74例患者的DAT陽性強弱度、放散液和血清中抗體特異性比較、經(jīng)稀釋后的放散液中的抗體特異性，探討放散試驗在輸血前檢查中的應用。結果74例DAT陽性反應強弱度為：W+（13.5%），1+（31.1%），2+（32. 4%），3+（16.2%），4+（6.8%）；放散后抗體鑒定32例為陰性，16例放散液檢測到特異性同種抗體，和患者血清中的一致，并且所有患者均有輸血史；26例放散液為全凝集，進行了稀釋，其中4例檢測到了同種抗體。結論抗體放散試驗在輸血前檢查中并為常規(guī)試驗，但對于DAT陽性的患者來說進行放散試驗是很有必要的。

DAT；輸血前檢查；放散試驗；同種抗體；抗體效價

直接抗人球蛋白試驗（DAT）是用于檢測紅細胞是否被不完全抗體或補體所致敏。通過對紅細胞進行放散試驗，能檢測出包被在紅細胞上IgG抗體的特異性。有文獻[1]指出獻血者中1：14000至1：1000的人和1%~15%的住院患者DAT試驗會為陽性，但是并不一定發(fā)生免疫介導的紅細胞破壞?？贵w放散試驗根據(jù)抗原抗體反應可逆的原理，將紅細胞表面的抗體釋放出來，再通過對放散液進行抗體鑒定來明確是什么樣的抗體導致患者DAT陽性?，F(xiàn)對DAT陽性患者采集樣本進行放散和抗體檢測，以探討輸血前檢查中DAT和放散試驗的必要性。

1 材料與方法

1.1 研究對象2012年1月至2015年12月鄭州地區(qū)各級醫(yī)院送檢并經(jīng)檢測DAT為陽性的患者樣本74例。

1.2 試劑儀器KA-2200小型臺式血型血清學離心機（日本久保田公司）；抗-IgG+C3d、抗-IgG、抗-C3d、抗-M、抗-P（均為上海血液生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品）；抗-E、抗-e、抗-C、抗-c(美國Immucor公司產(chǎn)品)；抗體鑒定16系譜細胞（荷蘭Sanquin公司產(chǎn)品）；6%白蛋白、IgG致敏紅細胞、酸放散試劑盒（長春博德生物技術有限責任公司產(chǎn)品）。

1.3 直接抗人球蛋白試驗（試管法）[2]將EDTA抗凝的血液樣本用生理鹽水洗滌3次后配置成3%的紅細胞懸液，取2支干凈試管，分別標記為測定管和對照管，向2支試管中分別加入1滴3%的紅細胞懸液，再向測定管中加入抗人球蛋白試劑（AHG）1滴，向對照管中加入6%白蛋白1滴，混勻，1000×g離心15s，觀察凝集情況，評分并記錄結果。立即離心測定管出現(xiàn)凝集，而6%白蛋白對照管未出現(xiàn)凝集，直接抗球蛋白試驗（DAT）陽性，并根據(jù)凝集強弱度評分。如果6%白蛋白對照管在離心后出現(xiàn)凝集，則實驗結果無效。如果試驗過程中未觀察到凝集，加入IgG致敏紅細胞后發(fā)生凝集，則DAT為陰性。如果IgG致敏紅細胞不凝集，陰性結果無效，需重復實驗。

1.4 抗體酸放散試驗[2]取DAT陽性待檢血樣，離心棄去血清或血漿，用生理鹽水洗滌4次，留取約1ml的最后洗滌液，將1ml的待檢壓積紅細胞與1ml酸放散液混合均勻，室溫孵育1~2min，3000r/ min離心1min，立即將放散液移至另一支干凈試管，加入中和液調至pH值為近中性。

1.5 抗體鑒定試驗取17支干凈試管，分別標記為1~16號和自身對照，每管中先各加入2滴受檢者血清或放散液，再分別加入1滴對應的3%的1~ 16號譜細胞和自身對照紅細胞懸液，混勻后1000×g離心15s，觀察凝集情況，評分并記錄結果，根據(jù)譜細胞格局表判斷抗體特異性。37℃孵育30min。1000×g離心15s，觀察溶血和凝集情況，評分并記錄結果，生理鹽水洗滌紅細胞3次，最后一次洗滌盡量移除上清，向紅細胞扣里加入抗人球蛋白試劑（AHG）1滴，充分混勻。1000×g離心15s。觀察溶血和凝集情況，評分并記錄結果。加入IgG致敏的試劑紅細胞確認陰性結果的有效性。根據(jù)譜細胞格局表判斷抗體特異性。

2 結果

2.1 DAT陽性強弱度特性和放散液檢測結果74例DAT陽性反應凝集強弱度評分結果：W+（2分）為13.5%；1+（5分）31.1%；2+（8分）32.4%；3+（10分）16.2%；4+（12分）6.8%。見表2。

表1 74例DAT陽性凝集強弱度和放散液抗體鑒定結果

表2 放散液中的抗體和血清中的抗體特異性比較

表3 稀釋后的放散液和血清中的抗體特異性比較

2.2 患者放散液和血清的抗體特異性比較74例患者進行抗體放散試驗，放散液進行抗體鑒定，32例為陰性，26例全凝集，16例在放散液中檢測到抗體特異性，并且在患者的血清中也存在這些抗體見表3。所有16例患者均有輸血史，DAT陽性強弱度為W+到2+見表2。

2.3 患者經(jīng)稀釋后的放散液和血清的抗體特異性比較26例放散液全凝集患者的DAT陽性強弱度為1+到4+見表2，所有放散液與試劑譜細胞均為全凝集。對這26例放散液用0.9%生理鹽水進行1：1稀釋，然后進行抗體鑒定。結果4例稀釋后的放散液檢測到抗體的特異性，并且有2例在血清中未檢測到抗體特異性。見表4。

3 討論

放散試驗的目的是從致敏紅細胞上釋放抗體分子。放散方法的原理：⑴通過改變抗原抗體反應的熱力學結構，⑵通過中和或扭轉的力量破壞抗原抗體復合物，⑶通過破壞抗原抗體結合位置的結構。通常的目標是重新獲得有活性的抗體[1]。常用的放散方法有熱放散、乙醚放散、甘氨酸放散和二磷酸氯喹放散等。熱放散通常僅用于因ABO不相合引起的HDFN的調查，因為這些方法對ABO系統(tǒng)以外的抗體放散效果不好；乙醚放散常用于Rh系統(tǒng)引起的HDFN的檢測，但乙醚可導致紅細胞的破壞；甘氨酸在移除IgG自身抗體和同種抗體的能力上顯著優(yōu)于其他方法，但對Kell系統(tǒng)的抗原幾乎完全破壞；二磷酸氯喹放散對移除致敏紅細胞上抗體是有效的，雖然沒有甘氨酸和熱放散移除的能力強，但是它可以使DAT陽性減弱[3-6]。因此需要根據(jù)不同的試驗目的選擇放散試驗的方法，本研究選用移除IgG抗體能力優(yōu)于其他方法的甘氨酸放散方法。

本研究對DAT陽性的凝集強弱程度與放散液檢測結果做了分析（表2），發(fā)現(xiàn)16例放散液中有特異性抗體的患者，DAT凝集等級在W+至2+之間，Nathalang O等[7]的研究中對DAT陽性、放散液發(fā)現(xiàn)有抗體的21例患者進行DAT凝集強度統(tǒng)計也均在W+至2+之間，戴小波等[8]的研究結果中57例DAT陽性的非自身免疫性溶血性貧血患者的DAT凝集強弱度也在W+至2+之間，與本研究結果基本一致。

對74例DAT陽性患者進行抗體放散試驗，并對放散液進行抗體特異性鑒定，32例為陰性，26例全凝集，16例在放散液中檢測到抗體特異性，并且在患者的血清中也存在這些抗體，詳見表3。26例患者經(jīng)放散后，放散液與試劑譜細胞反應為全凝集，本研究又利用抗體稀釋后能夠將混合抗體分開，以有效的去除一種抗體以便檢測另一種抗體這一原理，為了去除自身抗體或其他抗體的影響，用0.9%生理鹽水進行稀釋后，用試劑譜細胞再次檢測，結果4例分別存在有抗-Ce、抗-E、抗-Ec和抗-Jka，這是因為患者這些抗體完全吸附到了紅細胞表面，而自生抗體的存在又影響了這些抗體的檢出，對放散液進行稀釋后，這些抗體才得以被檢測到。更有意義的是其中有2例放散液中發(fā)現(xiàn)的抗-Ec、抗-Jka（表4）在患者血清中并未檢測到，這很可能是這兩個抗體的數(shù)量較少，全部吸附到了患者的紅細胞上，以至于血清中無法檢測到，僅能通過放散試驗檢測到。Yazer MH[9]也有同樣發(fā)現(xiàn)12.7%的樣本在放散后發(fā)現(xiàn)了血清中沒有檢測到的抗體。

紅細胞放散液中的特異性同種抗體多為免疫性抗體，其產(chǎn)生原因有：⑴受血者的血液中有同種抗體，與獻血者紅細胞上的抗原發(fā)生反應；⑵獻血者的血漿、血漿衍生物以及紅細胞制品有同種抗體，與受血者的抗原發(fā)生反應；四、母親血液中同種抗體通過胎盤，包被在胎兒紅細胞膜上；⑶器官移植和骨髓移植所產(chǎn)生的抗體等。目前輸血規(guī)程中規(guī)定輸血前檢測僅包括ABO、Rh血型和交叉配血試驗，DAT和抗體放散試驗以及抗體篩選和抗體鑒定未列入內；而供血者常規(guī)檢查包括ABO、Rh血型，未包括抗體篩選和抗體鑒定。當患者在輸注血液制品時一旦交叉配血試驗漏檢或遇到弱的抗體，患者就有可能輸入紅細胞上抗原相對應的抗體或血漿中抗體相對應的抗原，導致DAT陽性而發(fā)生溶血反應。所以對患者和供血者進行抗體篩選和抗體鑒定是很有必要的[10]，而放散試驗作為輸血前常規(guī)檢查可能是沒有必要的，但對于有溶血性輸血反應、自身溶血性貧血以及近期有過輸血史和輸血前檢查中發(fā)現(xiàn)有抗體的DAT患者來說，進行放散試驗還是非常有必要的。特別是當放散試驗發(fā)現(xiàn)了血清中所沒有檢測到的抗體，在給患者輸注紅細胞制品時，就應避開這些相應的抗原，否則輸血只會使患者的溶血反應加重。

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2017-01-03)