孔令印，王挺，賀權(quán)責(zé)，冒燕，申靜靜，宣黎明，祝軼君，薛永峰，孫丹鳳，劉慧敏，梁波

(1.蘇州貝康醫(yī)療器械有限公司，江蘇蘇州 215001；2.蘇州市立醫(yī)院遺傳中心，江蘇蘇州 215002；3.上海交通大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，上海 200240)

·臨床檢驗技術(shù)研究·

染色體特異位點(diǎn)篩選方法在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測中的應(yīng)用*

孔令印1，王挺2，賀權(quán)責(zé)2，冒燕1，申靜靜1，宣黎明1，祝軼君1，薛永峰1，孫丹鳳1，劉慧敏1，梁波3

(1.蘇州貝康醫(yī)療器械有限公司，江蘇蘇州 215001；2.蘇州市立醫(yī)院遺傳中心，江蘇蘇州 215002；3.上海交通大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，上海 200240)

目的 建立一種基于染色體特異位點(diǎn)測序進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的方法，以替代目前傳統(tǒng)的基于全基因組測序的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)。方法 采集200例已知胎兒核型的孕婦血漿樣本，通過數(shù)據(jù)庫篩選挑選出13、18、21號染色體上特異性的位點(diǎn)，通過探針捕獲的方式進(jìn)行特異性片段的捕獲，針對特異性片段進(jìn)行測序分析，通過Z值計算來判斷是否存在染色體非整倍體異常。結(jié)果 染色體特異位點(diǎn)篩選法檢出7例21三體胎兒、3例18三體胎兒，1例13三體胎兒，結(jié)果與全基因組高通量測序法一致。結(jié)論 基于染色體特異位點(diǎn)測序法具有檢測成本低、檢測通量高的優(yōu)勢，有望替代全基因組高通量測序法進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前篩查。

染色體特異位點(diǎn)測序；無創(chuàng)產(chǎn)前篩查；高通量測序

1997年，Lo等[1]在孕婦的外周血漿中發(fā)現(xiàn)了胎兒的游離DNA，使得從理論上可以通過孕婦血漿游離DNA的檢測判斷胎兒染色體是否異常。然而孕婦血漿中的胎兒游離DNA片段短，含量低，高背景的母體游離DNA給全面檢測胎兒染色體帶來了諸多困難。近年來研究發(fā)現(xiàn)，可用高通量測序來分析母體外周血中的胎兒游離DNA，并通過隨后大量的臨床試驗驗證其準(zhǔn)確率可達(dá)99%[2-4]。然而，該技術(shù)需要對整個基因組DNA片段進(jìn)行檢測，測序量較大，導(dǎo)致檢測價格較高。2012年，Ariosa公司發(fā)現(xiàn)，通過捕獲21、18號染色體上的特異性片段進(jìn)行測序分析，可顯著降低測序所需的數(shù)據(jù)量[5]。因此,本研究設(shè)計捕獲了13、18、21號染色體上的特異性片段，通過Z檢驗分析是否存在13、18、21號染色體非整倍體，旨在提高1張測序芯片的樣本檢測通量，降低檢測成本，以期替代目前無創(chuàng)產(chǎn)前檢測常規(guī)的高通量測序方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2014年5月至2015年3月在蘇州市立醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診的孕婦外周血樣本200例。孕齡為22～40周歲，平均孕齡34.5周歲，取樣時孕周14～28周，平均孕周20.1周。納入標(biāo)準(zhǔn)：高齡孕婦(≥35歲)、唐氏生化篩查高風(fēng)險(唐氏風(fēng)險≥1/270, 18三體風(fēng)險≥1/350)及中等風(fēng)險(唐氏風(fēng)險1/270～1/1 000, 18三體風(fēng)險1/350～1/1 000)孕婦。本研究經(jīng)孕婦及家屬知情同意，獲該醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑 2720 ABI PCR儀、Sorvall ST 16R冷凍離心機(jī)、Qubit 2.0熒光定量儀、Ion Proton高通量測序儀(美國Thermo Fisher公司)，DH300恒溫金屬浴(杭州瑞誠儀器公司)； AMPure XP 磁珠純化試劑(美國Beckman公司)，血漿核酸提取試劑盒(Circulating Nucleic Acid Kit，德國Qiagen公司)，Pfusion 聚合酶(Fermentas公司)，TdT末端原位轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs(美國Enzymatics公司)，Myone C1磁珠(Dynal，美國Thermo Fisher公司)，生物素-16-dUTP(Roche公司)。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)無創(chuàng)產(chǎn)前檢測 采集各孕婦外周血樣本10 mL，4 ℃、1 600×g離心 10 min，取上清液，16 000×g離心10 min，去沉淀，收集血漿600 μL，送蘇州市立醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)無創(chuàng)產(chǎn)前高通量測序。高通量測序為高風(fēng)險的孕婦送蘇州市立醫(yī)院遺傳科進(jìn)行羊水或臍血采集及染色體核型分析。

1.3.2 血漿DNA提取 取2 mL血漿樣本，按照血漿核酸提取試劑盒說明書操作提取DNA，樣本用30 μL無核酸酶的ddH2O洗脫，并用Qubit 2.0熒光定量儀進(jìn)行濃度檢測，取濃度>0.5 ng/μL DNA樣本用于后續(xù)文庫構(gòu)建，樣本置-20 ℃保存。

1.3.3 染色體位點(diǎn)篩選 根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的人類基因組序列(GRCH Build 37)，對13、18、21號染色體特異位點(diǎn)進(jìn)行初步篩選，每個染色體上篩選500～1 000個初篩位點(diǎn)序列，需滿足以下條件：(1)序列長度范圍50～70 bp；(2)GC含量在45%～55%之間；(3)序列中不包含字符“N”；(4)與NCBI單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)庫(dbSNP)進(jìn)行比較，序列中不存在任何單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)；(5)與NCBI基因組變異數(shù)據(jù)庫(DGV)中拷貝數(shù)變異(CNV)信息進(jìn)行比較，位點(diǎn)不能包含在任何已知的CNV中。染色體特異位點(diǎn)篩選流程見圖1。

圖1 染色體特異位點(diǎn)篩選流程圖

1.3.4 探針合成 按照參考文獻(xiàn)[5-6]，分別從21、18、13號染色體上，隨機(jī)選擇500個特異位點(diǎn)序列，并在位點(diǎn)序列5′端、3′端以及序列中部各設(shè)計1段特異性位點(diǎn)結(jié)合寡核苷酸引物。所有的探針及引物均由上海生工公司設(shè)計并合成。

1.3.5 特異性位點(diǎn)片段分離 取20 μL血漿游離DNA，加入3 μL 150 pmoL的生物素-16-dUTP，0.5 μL TdT末端原位轉(zhuǎn)錄酶和5 μL 1×TdT末端原位轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，ddH2O補(bǔ)足至30 μL。37 ℃溫育1 h。用異丙醇沉降法除去多余的生物素，30 μL TE(pH 8.0,含10 mmol/L Tris-HCl, 0.1 mmol/L EDTA)緩沖液重懸DNA。反應(yīng)體系為50 μL，含50 μg/μL Myone C1磁珠(Dynal) 2 μL， Tris-HCl(60 mmol/L，pH 8.0)1 μL， EDTA(6 mmol/L)1 μL， NaCl2(100 mmol/L)3 μL， 35%甲酰胺2 μL，土溫-80 5 μL，3段探針各4 nmol/L(探針濃度為2 nmol/L, 各加入2 μL)，ddH2O補(bǔ)足體積。25 ℃溫育2 h，將連接有生物素的DNA固定至生物磁珠。反應(yīng)后用磁力架吸附磁珠， 50 μL清洗緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 1 mmol/L EDTA, 50 mmol/L NaCl2) 清洗磁珠，吸棄緩沖液后加入1 μL Taq 連接酶，37 ℃溫育1 h。用清洗緩沖液洗滌2次， 30 μL TE重懸，95 ℃反應(yīng)3 min，將連接好的探針從磁珠上洗脫下來，探針置-20 ℃保存。

1.3.6 模板鏈擴(kuò)增 通用引物序列根據(jù)Ion Proton測序平臺文庫的接頭序列設(shè)計，由上海生工公司合成。上游通用PCR引物序列：5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNTACACCGGCGTTATGCGTCGAGAC-3′，下游通用PCR序列：5′-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3′，其中10個N代表10個堿基的index序列。將1.3.5中的特異性位點(diǎn)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μL；包括 Pfu高保真聚合酶(1 U/μL)1 μL， Pfu聚合酶緩沖液5 μL， dNTPs(200 μmol/L)1 μL，ddH2O補(bǔ)足體積。用AMPure XP磁珠純化試劑盒純化樣品，并經(jīng)Qubit 2.0核酸蛋白定量儀進(jìn)行濃度測定，取>0.5 ng/μL的樣本進(jìn)行上機(jī)測序，樣本置-20 ℃保存。

1.3.7 高通量測序和數(shù)據(jù)分析 取上述PCR純化產(chǎn)物，送貝康醫(yī)療公司進(jìn)行高通量測序(Ion Proton測序平臺)，并將獲得的測序結(jié)果與選擇的片段數(shù)進(jìn)行匹配分析，分別統(tǒng)計13、18、21號染色體上每個位點(diǎn)片段數(shù)量。根據(jù)測序得到的13、18、21號染色體的片段數(shù)量進(jìn)行Z值計算，公式：

pj：21號染色體(或13、18號染色體)上位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化后的平均片段數(shù)量除以13、18、21號染色體上位點(diǎn)總和的標(biāo)準(zhǔn)化后的平均片段數(shù)量。平均片段數(shù)量按照20%切尾均值方法計算，即去除掉10%的最低值以及10%的最高值。p0：1個測序泳道中上所有樣品pj的中值。nj：13、18、21號染色體上位點(diǎn)平均片段數(shù)量的總和；Zj：樣本j的21號(或13號、18號)染色體值。根據(jù)以上公式，計算所有樣本13、18、21號染色體對應(yīng)的Z值，當(dāng)Z≥6時，判斷為三體，當(dāng)Z<6時，判斷為單體。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果 200例血清學(xué)篩查高危孕婦中，經(jīng)常規(guī)高通量測序檢測，發(fā)現(xiàn)其中有7例孕有21三體患兒，3例孕有18三體患兒，1例孕有13三體患兒，且均通過核型分析得到確診。

2.2 特異性位點(diǎn)捕獲結(jié)果 統(tǒng)計21、18、13號染色體上捕獲的片段數(shù)量，對200份血漿游離DNA的不同染色體片段捕獲效率進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果顯示，13號染色體上的平均捕獲效率為85.5%，18號染色體上的平均捕獲效率為92.2%，21號染色體上的平均捕獲效率為90.2%，均滿足分析需求。

2.3 捕獲片段測序結(jié)果 染色體特異位點(diǎn)測序法檢測出21號染色體三體(T21)7例，18號染色體三體(T18)3例，13號染色體三體(T13)1例。染色體特異位點(diǎn)無創(chuàng)產(chǎn)前檢測方法對21三體，18三體，13三體的檢測結(jié)果和常規(guī)高通量測序方法檢測結(jié)果一致。200例樣本對應(yīng)的Z值分布見圖2。

注：1～3分別為13、18、21號染色體。

圖2 13、18、21號染色體的Z值分布

3 討論

本研究建立了利用染色體特異位點(diǎn)進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前篩查的檢測體系。利用該體系對200例樣本驗證，發(fā)現(xiàn)其中189例陰性，7例T21，3例T18，1例T13，與傳統(tǒng)高通量測序的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測一致性達(dá)100%。相比高通量測序法，本研究建立的染色體特異位點(diǎn)進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前篩查的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)為克服了高通量測序技術(shù)針對整個基因組的所有染色體進(jìn)行檢測時需要測量大量無關(guān)數(shù)據(jù)的缺陷。全基因組高通量測序獲得的待檢染色體特異片段僅占20%，而染色體特異位點(diǎn)測序獲得的待檢染色體特異片段超過90%，需要的測序通量更低。此外，傳統(tǒng)的高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前檢測在Ion Proton平臺上最多可以同時檢測16個樣本，而本研究建立的方法可以同時檢測70個樣本，顯著降低無創(chuàng)產(chǎn)前檢測成本。

基于染色體特異位點(diǎn)的高通量測序法相比于全基因組測序法，在操作流程上增加了捕獲的步驟但省去了傳統(tǒng)的文庫構(gòu)建步驟，在操作步驟和時間花費(fèi)上并無太大差異，但值得一提的是全基因組測序是對全部的游離DNA進(jìn)行檢測，需要的血漿樣本量較少，一般臨床上采用600 μL的血漿提取DNA即可滿足檢測需求，而基于染色體特異位點(diǎn)的高通量測序法需要捕獲目標(biāo)染色體上的DNA片段進(jìn)行檢測，需要的樣本量較大，本研究中采用了2 mL的血漿樣本提取DNA，但仍是臨床上合理的取樣范圍。

本研究雖然對部分三體陽性樣本進(jìn)行了準(zhǔn)確檢測，但值得注意的是，本次研究中所用的樣本孕周均超過14周，胎兒游離DNA的含量較高，缺乏對于更早孕周樣本的檢測數(shù)據(jù)，且使用的均是既往樣本，缺乏雙盲實驗的數(shù)據(jù)，后續(xù)將加大樣本量開展臨床試驗，進(jìn)一步確認(rèn)該技術(shù)的準(zhǔn)確性。此外，本研究僅對21，18，13三體進(jìn)行了非整倍體的檢測，后續(xù)研究可將該技術(shù)擴(kuò)展到對其他染色體上的檢測以及對于染色體微缺失微重復(fù)的檢測，擴(kuò)大檢測范圍。

[1]Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF,etal. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J]. Lancet, 1997, 350(9076):485-487.

[2]林穎，胡平，季修慶，等.22q 11.2微重復(fù)伴先天性心臟缺損的產(chǎn)前分子遺傳學(xué)診斷[J].臨床檢驗雜志，2011,29(2)：103-105.

[3]Wong AI, Lo YM. Noninvasive fetal genomic, methylomic, and transcriptomic analyses using maternal plasma and clinical implications[J]. Trends Mol Med, 2015, 21(2):98-108.

[4]Zhang H, Gao Y, Jiang F,etal. Non-invasive prenatal testing for trisomies 21, 18 and 13: clinical experience from 146,958 pregnancies[J]. Ultrasound Obstet Gynecol, 2015,45(5):530-538.

[5]Sparks AB, Wang ET, Struble CA,etal. Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy[J]. Prenat Diagn, 2012, 32(1):3-9.

[6]Sparks AB, Struble CA, Wang ET,etal. Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18[J]. Am J Obstet Gynecol, 2012, 206(4):319 e1-e19.

(本文編輯：許曉蒙

The application of chromosome specific site selection method in noninvasive prenatal testing

KONGLing-yin1,WANGTing2,HEQaun-ze2,MAOYan1,SHENJing-jing1,XUANLi-ming1,ZHUYi-jun1,XUEYong-feng1,SUNDan-feng1,LIUHui-min1,LIANGBo3

(1.SuzhouBasecareMedicalDeviceCo.,Ltd.Suzhou215001,Jiangsu; 2.CenterforReproductionandGenetics,SuzhouHospitalaffiliatedtoNanjingMedicalUniversity，Suzhou215002,Jiangsu;3.SchoolofLifeSciencesandBiotechnology,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China)

Objective To establish a noninvasive prenatal testing(NIPT) method based on the chromosome specific site sequencing instead of the conventional whole genome sequencing. Methods Blood plasma samples from 200 pregnant women with known fetus karyotypes were collected. First, the specific loci on chromosome 13, 18 and 21 were selected by the database filter. Then, these specific loci were captured by probes, and were performed sequencing. Finally, chromosome aneuploidy was identified by the Z-score. Results Seven fetuses with 21-trisomy syndrome, 3 with 18-trisomy syndrome and 1 with 13-trisomy syndrome were detected by the chromosome specific site sequencing, and the results were accordant with those of the whole genome sequencing method. Conclusion The NIPT method based on the chromosome specific site sequencing has the advantages of low cost and high throughput, which may replace the NIPT method based on the whole genome sequencing.

chromosome specific site sequencing; noninvasive prenatal testing; high-throughput sequencing

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.02

江蘇省科技支撐計劃社會發(fā)展項目(BE2013654)。

孔令印，1980年生，男，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

梁波，博士，E-mail：liang01@basecare.cn。

R715.5

A

2016-11-25)