付濤，蘇丹華，劉原，劉卿，吳亮，陳盛霞，姜旭淦

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

人降鈣素原的原核表達(dá)、純化和鑒定

付濤，蘇丹華，劉原，劉卿，吳亮，陳盛霞，姜旭淦

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

目的 構(gòu)建人降鈣素原(procalcitonin，PCT)原核表達(dá)載體，獲得高純度PCT重組蛋白。方法 根據(jù)NCBI上PCT基因序列設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)擴增PCT基因，構(gòu)建PCT/pET-22b(+)重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌(E.coli)BL21中誘導(dǎo)表達(dá)；采用鎳柱親和層析法純化重組蛋白，用western blot和膠體金法對其進(jìn)行鑒定。結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR擴增產(chǎn)物約為350 bp。同源性比對分析結(jié)果表明，PCT基因片段(348 bp)成功插入pTG19-T載體，未出現(xiàn)堿基突變。用BamHⅠ和HindⅢ對重組表達(dá)載體雙酶切，得到約為350 bp和5 500 bp片段。SDS-PAGE電泳顯示PCT重組蛋白以可溶性形式存在，Mr約14 000，經(jīng)鎳柱親和層析法純化后即可獲得。western blot和PCT膠體金法結(jié)果呈陽性，顯示融合蛋白含組氨酸標(biāo)簽(His-tag)，成功表達(dá)出PCT重組蛋白。結(jié)論 應(yīng)用重組DNA技術(shù)成功構(gòu)建PCT基因融合重組表達(dá)載體，通過蛋白質(zhì)表達(dá)純化技術(shù)獲得PCT融合蛋白。

降鈣素原；原核表達(dá)；純化

降鈣素原(procalcitonin，PCT)是人11號染色體中降鈣素原基因表達(dá)的產(chǎn)物，由甲狀腺濾泡旁C細(xì)胞分泌產(chǎn)生，含有116個氨基酸，相對分子質(zhì)量(Mr)約為1 3000[1-2]。目前關(guān)于PCT的研究主要集中于PCT基因結(jié)構(gòu)、功能以及導(dǎo)致其升高的機制和臨床表現(xiàn)等，關(guān)于PCT檢測方法的研究較少[3]。研制PCT試劑盒所需要的高純度抗原和特異性抗體多數(shù)來自于國外公司，價格昂貴，并且因原料來源和質(zhì)量不一致導(dǎo)致不同廠家產(chǎn)品檢測結(jié)果相差較大，不利于檢測結(jié)果的臨床應(yīng)用和質(zhì)量控制。因此，獲得高純度PCT抗原，為建立免疫學(xué)檢測方法提供原材料，具有重要意義[4]。本研究通過構(gòu)建人PCT重組表達(dá)載體，得到了高純度的PCT融合蛋白，為研制PCT檢測試劑盒提供了試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 pET-22b(+)原核表達(dá)質(zhì)粒、pTG19-T質(zhì)粒、大腸埃希菌DH5α和BL21菌株均由本實驗保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 Taq Mater Mix PCR預(yù)混液、western blot化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(南京諾唯贊公司)，5 000 bp DNA Ladder、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(上海捷瑞公司)，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ(美國Thermo Fisher Scientific公司)，T4連接酶(日本TaKaRa公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、硝酸纖維素膜(武漢Boster公司);4TC-20恒溫振蕩器(上海金怡公司)，C5612超聲粉碎儀(寧波新芝公司)，F(xiàn)CQ凝膠成像儀及垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與基因擴增 用Primer Premier 6.0軟件，根據(jù)NCBI基因庫PCT基因全長序列(NM_001732.1)設(shè)計引物，PCT上游引物(F)：5′ -GGCGGATCCGCACCATTCAGGTCTGCCC-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點)， 下游引物(R)：5′-GGCAAGCTTGTTGGCATTCTGGGGCATG-3′(下劃線為HindⅢ 酶切位點)，產(chǎn)物長度為348 bp，退火溫度為56 ℃，引物由蘇州泓迅公司設(shè)計并合成。PCR反應(yīng)總體系25 μL,包括2×PCR Green Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，滅菌ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min; 95 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物片段大小，按照DNA膠回收試劑盒說明書操作回收目的片段。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將目的片段與pTG19-T克隆載體連接，構(gòu)建PCT/pTG19-T重組克隆載體，將其轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)DH5α中，經(jīng)氨芐篩選、PCR擴增及BamHⅠ酶切鑒定[5]，陽性克隆送蘇州泓迅公司測序。測序正確的陽性質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切，按照膠回收試劑盒說明書操作回收目的片段，通過T4連接酶與同樣雙酶切后的pET-22b(+)載體，連接反應(yīng)總體系為20 μL，包括PCT基因片段 11 μL, pET22b載體片段 6 μL, 10×連接緩沖液 2 μL, T4連接酶1 μL。構(gòu)建PCT/pET-22b(+)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)DH5α中，接種至含100 mg/L 氨芐西林的LB平板上篩選陽性克隆菌落，用LB液體培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)陽性菌落，按照質(zhì)粒小量制備試劑盒說明書操作提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定，酶切反應(yīng)總體系為20 μL，包括BamHⅠ 0.5 μL，Hind Ⅲ 0.5 μL，BamHⅠ Buffer 2 μL，滅菌ddH2O 13 μL。酶切產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 重組蛋白質(zhì)表達(dá)與可溶性分析 陽性菌落接種于含氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h，次日以1∶100稀釋接種于20 mL LB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液吸光度(A600 nm)達(dá)到0.6時，加入誘導(dǎo)劑IPTG至菌液終濃度為0.4 mmol/L,于37 ℃分別培養(yǎng)4 h、16 h終止，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集菌體，菌體用PBS重懸，取等體積重懸液與1×上樣緩沖液混勻，沸水中煮10 min，4 ℃、16 400 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，垂直電泳儀電壓110 V，電泳時間120 min，1 g/L考馬斯亮蘭染色液染色3 h，脫色液脫色2 h，F(xiàn)CQ凝膠成像儀觀察蛋白質(zhì)條帶結(jié)果。另取1.5 mL菌液于EP管中，室溫、12 000 r/min離心1 min，收集菌體沉淀；用500 μL PBS(pH 7.4)重懸菌體沉淀，超聲破碎后離心，吸取上清液至新EP管中，沉淀用500 μL PBS重懸。分別吸取30 μL的上清液和沉淀，進(jìn)行蛋白質(zhì)可溶性分析。

1.2.4 重組PCT蛋白的純化 用200 mL含氨芐西林LB液體培養(yǎng)基增菌。收集菌體，超聲破碎后，4 ℃、16 400 r/min離心30 min，收集上清液。依據(jù)鎳柱蛋白結(jié)合能力，將上清液和鎳柱顆粒以5∶1比例混合，于4 ℃結(jié)合4 h，用洗滌緩沖液(10 mmol/L咪唑)洗去雜蛋白，然后用洗脫緩沖液(250 mmol/L咪唑)洗脫，收集目的蛋白質(zhì)。

1.2.5 重組PCT蛋白的鑒定 取10 μL 純化蛋白與等體積1×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將目的蛋白以150 mA、 80 min電泳條件轉(zhuǎn)印至NC膜上，用50 g/L脫脂奶粉封閉30 min，以兔抗His標(biāo)簽抗體(1∶2 000稀釋)作為一抗，室溫溫育2 h，TBST緩沖液洗滌3次；以HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)作為二抗，室溫溫育1 h，TBST緩沖液洗滌3次后加入ECL顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀觀察顯影結(jié)果。將純化蛋白用PBS 1∶1 000稀釋，取10 μL加入膠體金法板條上樣孔中，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增PCT基因結(jié)果 用PCR法擴增PCT基因后，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，約在350 bp處出現(xiàn)條帶，與PCT基因片段理論擴增大小(348 bp)相符。見圖1。

2.2 重組克隆載體PCT/pTG19-T的鑒定 結(jié)合pTG19-T克隆載體多克隆位點的特點，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ對重組克隆載體PCT/pTG19-T進(jìn)行單酶切，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示約在350 bp處出現(xiàn)條帶，與理論大小相符(圖2)。外送公司測序結(jié)果顯示PCT片段成功插入pTG19-T載體，未出現(xiàn)堿基突變(圖3)。

注：M，DL 5000 DNA marker；1，目的基因PCR擴增產(chǎn)物；2，陰性對照。

圖1 目的基因PCR擴增產(chǎn)物

注：M，DL 5000 DNA marker；1，重組質(zhì)粒PCT/pTG19-T；2，BamHⅠ酶切產(chǎn)物。

圖2 重組質(zhì)粒PCT/pTG19-T酶切鑒定

注：A，測序所得堿基序列；B，PCT目的基因序列。

圖3 測序結(jié)果同源性比對分析

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒PCT/pET-22b(+)的鑒定 用BamHⅠ和HindⅢ對重組表達(dá)質(zhì)粒PCT/pET-22b(+)進(jìn)行雙酶切后，得到大小約為350 bp和5 500 bp的2個片段，與目的條帶和載體大小一致，表明PCT基因被完整插入到表達(dá)載體pET-22b(+)中。見圖4。

注：M，DL 5000 DNA marker； 1，重組質(zhì)粒PCT/pET22b(+)雙酶切產(chǎn)物。

圖4 PCT/pET22b(+)重組質(zhì)粒的鑒定

2.4 重組PCT蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，在Mr約為14 000處出現(xiàn)目的蛋白質(zhì)條帶；另經(jīng)超聲處理菌體進(jìn)行可溶性分析，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白以可溶性形式存在于上清液中。見圖5。

注：M，蛋白質(zhì)Marker；1，帶有pET22b的E.coliBL21菌株；2～3，PCT/pET22b經(jīng)IPTG分別誘導(dǎo)4、16 h；4，PCT/pET22b未誘導(dǎo)； 5～6，可溶性分析(上清液)；7～8，可溶性分析(沉淀)。

圖5 重組質(zhì)粒PCT/pET22b蛋白質(zhì)表達(dá)

2.5 重組PCT蛋白的純化 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和層析純化后，得到單一的純化蛋白質(zhì)條帶。見圖6。

注：M，蛋白質(zhì)Marker；1，未純化蛋白；2，純化蛋白。

圖6 親和層析純化后的重組PCT蛋白

2.6 western blot和膠體金法的鑒定 western blot結(jié)果顯示在Mr約為14 000處的條帶可與抗His標(biāo)簽抗體發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，與重組PCT蛋白大小相符(Mr為13 600)。將純化PCT蛋白加入膠體金法板條上樣孔，可見質(zhì)控線(C)和檢測線(T)均為紅色，PBS對照僅質(zhì)控線(C)為紅色，可知該純化蛋白為PCT(圖7)。

注： A，western blot結(jié)果；1，未純化PCT蛋白；2，純化的重組PCT蛋白； B，膠體金法檢測結(jié)果；1，PBS對照；2，純化的重組PCT蛋白。

圖7 western blot和膠體金法鑒定重組PCT蛋白

3 討論

本研究應(yīng)用PCR技術(shù)擴增PCT基因片段，并用pTG19-T載體克隆功能插入原核表達(dá)載體pET22b(+)上的多克隆位點，成功構(gòu)建重組表達(dá)載體；目的片段經(jīng)PCR擴增后，在其3′端加上堿基A，利用3′端帶有堿基T的pTG19-T載體，先構(gòu)建含有目的基因的重組T載體，限制性內(nèi)切酶酶切后得到帶有粘性末端的目的片段，即可克隆至帶有粘性末端的pET22b(+)表達(dá)載體。

本研究所選的pET22b(+)表達(dá)載體的優(yōu)勢在于氨基末端帶有6個His標(biāo)簽，該標(biāo)簽與鎳柱顆粒結(jié)合實現(xiàn)目的蛋白親和層析純化，對蛋白質(zhì)的分泌、折疊和功能基本上無影響[6]，并且因其免疫原性小，不會對后續(xù)免疫動物制備抗體產(chǎn)生影響，實驗后期無需切除標(biāo)簽，簡化了實驗步驟。

外源蛋白在大腸埃希菌中表達(dá)形式分為兩種：存在于上清液中可溶性蛋白質(zhì)和不可溶性包涵體沉淀。在目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過程中，不同的誘導(dǎo)表達(dá)條件可導(dǎo)致不同的蛋白質(zhì)表達(dá)量以及蛋白質(zhì)表達(dá)形式；誘導(dǎo)溫度為37 ℃時，蛋白質(zhì)以包涵體形式為主，誘導(dǎo)溫度為16 ℃時，目的蛋白以可溶性蛋白質(zhì)為主；采用低溫誘導(dǎo)表達(dá)條件能有效的增加可溶性蛋白質(zhì)的比例，有利于蛋白質(zhì)純化[7]。

PCT定量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于穩(wěn)定的PCT標(biāo)準(zhǔn)品[8-9]，臨床實驗室或檢驗科使用的PCT標(biāo)準(zhǔn)品都是進(jìn)口試劑，如何制備穩(wěn)定的PCT標(biāo)準(zhǔn)品國內(nèi)尚未見文獻(xiàn)報道，在獲取了外源性PCT蛋白，本課題組后續(xù)將對PCT蛋白的穩(wěn)定性及最佳保存方法作進(jìn)一步的研究，探討PCT蛋白的最佳貯存方式以及PCT標(biāo)準(zhǔn)品的制備和臨床初步應(yīng)用。

[1]Foushee JA, Hope NH, Grace EE. Applying biomarkers to clinical practice: a guide for utilizing procalcitonin assays[J]. J Antimicrob Chemother,2012,67(11):2560-2569.

[2]Kettner J, Holek M, Franekova J,etal. Procalcitonin dynamics after long-term ventricular assist device implantation[J]. Heart Lung Circ,2016.pii:S1443-9506(16)31658-4.

[3]Kutz A, Hausfater P, Oppert M,etal. Comparison between B.R.A.H.M.S PCT direct, a new sensitive point-of-care testing device for rapid quantification of procalcitonin in emergency department patients and established reference methods - a prospective multinational trial[J]. Clin Chem Lab Med,2016,54(4):577-584.

[4]鄭怡麟，何瑩，陳安，等. 抗人降鈣素原特異性單克隆抗體的制備鑒定及初步應(yīng)用[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2013，35(6):523-526.

[5]蘇丹華. 剛地弓形蟲Prx體外抗氧化機制研究[D].鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué),2016.

[6]原飛，劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，張波，等. 剛地弓形蟲抑制蛋白的原核表達(dá)與免疫反應(yīng)性分析[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2015，33(1):21-24.

[7]張國勇，劉倩，李芳秋，等. 煙曲霉果膠裂解酶A重組蛋白的原核表達(dá)及抗原性分析[J]. 臨床檢驗雜志,2015，33(2):108-110.

[8]Meisner M. Update on procalcitonin measurements[J]. Ann Lab Med,2014,34(4):263-273.

[9]Yan ST, Sun LC, Jia HB,etal. Procalcitonin levels in bloodstream infections caused by different sources and species of bacteria[J]. Am J Emerg Med,2016. pii: S0735-6757(16)30916-0.

(本文編輯：許曉蒙)

Prokaryotic expression, purification and identification of human procalcitonin

FUTao,SUDan-hua,LIUYuan,LIUQing,WULiang,CHENGSheng-xia,JIANGXu-gan

(SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu,China)

Objective To construct the prokaryotic expression vector of human procalcitonin(PCT) and obtain the highly purified recombinant PCT protein. Methods PCT primers were designed based on the sequence ofPCTgene from NCBI, andPCTgene was amplified by PCR. Then, the recombinant vector PCT/pET-22b(+) was constructed and transferred intoE.coliBL21 to induce the expression of recombinant PCT protein. Last, the recombinant PCT protein was purified by the nickel column affinity chromatography and identified by Western blot and the colloidal gold method, respectively. Results The results of agarose gel electrophoresis showed that the product of PCR amplification was about 350 bp. The homology comparison analysis revealed that thePCTgene fragment(348 bp) was successfully inserted into pTG19-T vector, and that no any base mutation was found. When the recombinant plasmid of PCT/pET-22b(+) was digested withBamH I andHindⅢ, two pieces of about 350 bp and 5 500 bp were obtained. SDS-PAGE showed that the recombinant PCT protein with about 14 000 ofMr was existed in soluble form, and was easily obtained by the nickel column affinity chromatography. Moreover, western blot and the colloidal gold method demonstrated that the recombinant PCT protein was successfully expressed and contained histidine label(His-tag). Conclusion The recombinant vector PCT/pET-22b(+) is successfully constructed by the recombinant DNA technology, and the recombinant PCT fusion protein is successfully obtained by the nickel column affinity chromatography.

procalcitonin; prokaryotic expression; purification

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.19

付濤，1986年生，男，碩士研究生，研究方向為臨床生化診斷試劑的研發(fā)。

姜旭淦,副教授，博士，E-mail:jiangxugan1962@163.com。

R446.1

A

2016-12-31)