任瑤，伍勇，黃利華，邢曉為

(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院a.醫(yī)學(xué)實驗中心，b.檢驗科，長沙 430013)

人睪丸蛋白SPAG4L與KASH結(jié)構(gòu)域蛋白Nesprin-3的相互作用*

任瑤a,b，伍勇b，黃利華a，邢曉為a

(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院a.醫(yī)學(xué)實驗中心，b.檢驗科，長沙 430013)

目的 探討含SUN(Sad, UNC-84)結(jié)構(gòu)域的人睪丸蛋白SPAG4L(sperm-associated antigen 4 like)與具有KASH(Klarsicht, ANC-1 and Syne homology)結(jié)構(gòu)域的核膜血影重復(fù)蛋白3(nuclear envelop spectrin repeat proteins 3，Nesprin-3)之間的相互作用。方法 用生物信息學(xué)方法對SPAG4L蛋白進(jìn)行分析，通過體外轉(zhuǎn)染實驗，觀察SPAG4L的亞細(xì)胞定位；并用免疫熒光技術(shù)、免疫共沉淀和雙分子熒光互補(bǔ)實驗檢測SPAG4L是否與KASH結(jié)構(gòu)域蛋白Nesprin-3存在相互作用。結(jié)果 生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，SPAG4L蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)；亞細(xì)胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPAG4L蛋白定位于核膜和胞漿；免疫熒光、免疫共沉淀和雙分子熒光互補(bǔ)實驗結(jié)果表明，SPAG4L蛋白與Nesprin-3蛋白質(zhì)相互作用，形成LINC(linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton)復(fù)合物。結(jié)論 SPAG4L與Nesprin-3 能夠相互作用，形成LINC 復(fù)合物,對了解SPAG4L蛋白在精子發(fā)生中的作用具有重要的意義。

SPAG4L；核膜血影重復(fù)蛋白3；相互作用；LINC復(fù)合物；精子發(fā)生

SUN蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的核膜蛋白家族，共有5個成員：SUN1、SUN2、SUN3、SPAG4(sperm-associated antigen 4)和SPAG4L，其共同特征是C端包含一個保守的SUN結(jié)構(gòu)域[1]。SPAG4L是SUN蛋白家族第5個成員，也稱為SUN5或TSARG4(testis and spermatogenesis related gene 4)，由本課題組最先克隆并提交GenBank(AF401350)[2]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在小鼠動物模式中，Spag4L在睪丸中特異性表達(dá)，受生長發(fā)育調(diào)控，參與精子減數(shù)分裂過程[3-4]。

核膜血影重復(fù)蛋白3(Nesprin-3)是一個KASH結(jié)構(gòu)域蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在睪丸滋養(yǎng)細(xì)胞中Nesprin-3介導(dǎo)中間纖維與核膜的連接[5]。在小鼠精子細(xì)胞中，Nesprin-3與 Spag4相互作用[6]。由于SPAG4L與SPAG4高度同源，本研究旨在分析SPAG4L和Nesprin-3的相互作用，為闡明SPAG4L在精子發(fā)生中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、儀器與試劑 人睪丸畸胎瘤細(xì)胞Ntera-2由本實驗室保存；兔抗人Nesprin-3多克隆抗體(ab74261，英國Abcam公司)；小鼠抗人GAPDH抗體(1E6D9，武漢三鷹公司)；Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(KGAB019，Keygen公司)；Flag標(biāo)簽抗體(AF519，Beyotime公司)；小鼠IgG(A7028，Beyotime公司)； 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶(美國Gibco公司)；pEGFP-SPAG4L重組質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)載體由本實驗室保存；真核表達(dá)載體pCMV-C-Flag(D2632， Beyotime公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒、高保真酶(PrimeSTAR Max Premix)、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒和連接酶(日本TaKaRa公司)；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、XhoⅠ(美國Fermentas公司); DAPI染液(C1005，Beyotime公司)；Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；胎牛血清購(FS101-02，北京全式金公司)；Triton X-100(T8200, Solarbio公司)；瓊脂糖(美國Invitrogen公司)；G418(e859，美國Amresco公司)；人睪丸cDNA為本實驗室保存；PCR引物合成和質(zhì)粒測序(上海生工公司)；PCR儀(美國ABI公司)；Eclipse 80i熒光顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析網(wǎng)站ExPASy(http://www.expasy.org/proteomics)中TMHMM Server v.2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對SPAG4L的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.2 亞細(xì)胞定位 將Ntera-2細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，按每孔1×105個接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合率達(dá)80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染步驟：4 μg pEGFP-N1-SPAG4L重組質(zhì)粒和10 μL Lipofectamine?2000分別用不含血清的1640培養(yǎng)基稀釋，靜置5 min后混合，靜置30 min，加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(含Ntera-2細(xì)胞)中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，5 h后更換含有血清的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，用0.01 mol/L PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。DAPI染液(1∶2 000稀釋)復(fù)染細(xì)胞核。在倒置熒光顯微鏡下觀察出現(xiàn),綠色熒光為SPAG4L的亞細(xì)胞定位。

1.2.3 SPAG4L與Nesprin-3的共定位 在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪上蓋玻片，取上述轉(zhuǎn)染后的Ntera-2細(xì)胞，按每孔1×105個接種，用1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定10 min，0.5% Triton X-100通透處理10 min，PBS洗滌3次，5% BSA封閉30 min。實驗組用兔抗人Nesprin-3多克隆抗體(1∶200稀釋)溫育，對照組用5% BSA溫育，均室溫溫育3 h，PBS洗滌3次，每次5 min。加入Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶300稀釋)室溫溫育1 h，PBS洗滌3次，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察紅色熒光標(biāo)記的Nesprin-3蛋白和綠色熒光標(biāo)記的SPAG4L蛋白的定位，若Nesprin-3蛋白和SPAG4L蛋白能夠共定位，紅色熒光和綠色熒光疊加可出現(xiàn)黃色熒光。

1.2.4 免疫共沉淀實驗 以人睪丸cDNA為模板，應(yīng)用PCR擴(kuò)增人SPAG4L基因(AF401350)開放閱讀框。采用PCRDESN.EXE軟件設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，正向引物序列：5′-CGAAGCTTATGCCACGGTCCTCAAGGAG-3′(HindⅢ 限制性酶切)，反向引物序列：5′-CGCTCGAGATCTCTCTTAGGGTAGGGGTTC-3′(XhoⅠ限制性酶切),擴(kuò)增片段大小為1 153 bp。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 19 μL, 人睪丸cDNA 4 μL, 20 μmol/L上、下游引物各1 μL，PrimeSTAR Max Premix 25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2.5 min；94 ℃ 30 s, 64 ℃ 30 s, 72 ℃ 1.5 min ，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后按HindⅢ和XhoⅠ說明書操作進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳后，用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，并將回收的擴(kuò)增片段克隆到pCMV-C-Flag載體，挑選陽性克隆，送上海生工公司進(jìn)行測序，以驗證插入片段是否正確，如果插入片段正確，則表示pCMV-C-Flag-SPAG4L重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。用Lipofectamine?2000將pCMV-C-Flag-SPAG4L重組質(zhì)粒按4 μg質(zhì)?！?0 μL Lipofectamine?2000的比例轉(zhuǎn)染至Ntera-2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后用1 000 μg/L G418進(jìn)行篩選實驗。將篩選后的Ntera-2細(xì)胞用培養(yǎng)皿擴(kuò)增，當(dāng)篩選后的細(xì)胞融合度至80%～90%時，按照文獻(xiàn)[7]方法裂解細(xì)胞、提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行免疫共沉淀實驗，對照組用小鼠IgG替代 Flag標(biāo)簽抗體進(jìn)行實驗。最后，用Flag、Nesprin-3和GAPDH特異性抗體對免疫共沉淀的產(chǎn)物進(jìn)行 western blot分析[7]，以觀察Nesprin-3蛋白是否能夠被免疫沉淀。

1.2.5 雙分子熒光互補(bǔ)實驗(BiFC) 以人睪丸cDNA為模板，用PCR擴(kuò)增SPAG4L和Nesprin-3的開放閱讀框架， PCR擴(kuò)增條件、反應(yīng)體系、PCR產(chǎn)物純化參照1.2.4提供的方法進(jìn)行。參照文獻(xiàn)[8]方法構(gòu)建pcDNA3.1(+)-nesprin-3-YN 和pcDNA3.1(+)-SPAG4L-YC重組質(zhì)粒，并對所插入的序列進(jìn)行測序驗證。按Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，將pcDNA3.1(+)-nesprin-3-YN 和pcDNA3.1(+)-SPAG4L-YC質(zhì)粒同時導(dǎo)入到Ntera-2細(xì)胞作為實驗組，以只轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-nesprin-3-YN或pcDNA3.1(+)-SPAG4L-YC質(zhì)粒為對照組。轉(zhuǎn)染48 h后，4%多聚甲醛固定轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞10 min， PBS洗滌3次，每次5 min。DAPI染液(1∶2 000稀釋)復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，以黃色熒光表示二者存在直接相互作用。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果 用ExPASy中的TMHMM Server v. 2.0軟件對SPAG4L的序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPAG4L有2個潛在的跨膜域(圖1)，說明SPAG4L是一個跨膜蛋白。

注：紅色代表跨膜域、藍(lán)色代表內(nèi)部、紫色代表外部，圖中顯示有2個潛在的跨膜域。

圖1 TMHMM Server v. 2.0軟件分析SPAG4L結(jié)果

2.2 SPAG4L的亞細(xì)胞定位 將pEGFP-SPAG4L重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Ntera-2細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，帶有綠色熒光的SPAG4L融合蛋白在核膜和胞漿中均有分布，說明SPAG4L是核膜蛋白(圖2)。

注： GFP-SPAG4L融合蛋白呈綠色熒光；細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。

圖2 SPAG4L亞細(xì)胞定位結(jié)果(×400)

2.3 SPAG4L與Nesprin-3共定位實驗結(jié)果 免疫熒光實驗結(jié)果顯示，帶有紅色標(biāo)記的Nesprin-3蛋白分布在核膜和胞漿中。該蛋白質(zhì)能夠與帶綠色熒光的SPAG4L蛋白共定位發(fā)出黃色熒光，說明SPAG4L與Nesprin-3能夠共定位(圖3)。

2.4 免疫共沉淀實驗結(jié)果 結(jié)果表明，Nesprin-3能夠被免疫共沉淀下來，而對照組沒有檢測到Nesprin-3蛋白條帶，表明在Ntera-2細(xì)胞中，SPAG4L能夠與Nesprin-3蛋白質(zhì)相互作用。內(nèi)參GAPDH在各組細(xì)胞總蛋白中無沒有明顯差異(圖4)。

注：綠色、紅色、藍(lán)色分別代表SPAG4L蛋白、Nesprin-3蛋白、細(xì)胞核的顏色，黃色代表SPAG4L和Nesprin-3共定位。

圖3 SPAG4L和Nesprin-3共定位結(jié)果(×400)

注：A～C分別為用Nesprin-3、Flag以及GAPDH特異性抗體檢測。TL，全細(xì)胞裂解液；anti-IgG，小鼠IgG陰性對照；anti-Flag，實驗組。

圖4 SPAG4L和Nesprin-3免疫共沉淀實驗結(jié)果

2.5 雙分子熒光互補(bǔ)實驗結(jié)果 將pcDNA3.1(+)-Nesprin-3-YN 和pcDNA3.1(+)-SPAG4L-YC同時導(dǎo)入到Ntera-2細(xì)胞后，在細(xì)胞中出現(xiàn)了黃色熒光，而只轉(zhuǎn)入pcDNA3.1(+)-SPAG4L-YC或pcDNA3.1(+)-nesprin-3-YN的細(xì)胞不產(chǎn)生熒光，說明SPAG4L與Nesprin-3之間存在直接相互作用(圖5)。

注：藍(lán)色代表細(xì)胞核顏色，黃色代表SPAG4L與Nesprin-3直接相互作用形成的黃色熒光蛋白。

圖5 雙分子熒光互補(bǔ)實驗結(jié)果(×400)

3 討論

SUN蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的核膜蛋白，SUN1、SUN2廣泛分布在各種真核細(xì)胞中，而SPAG4和SPAG4L主要在睪丸中分布，與精子發(fā)生密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SUN結(jié)構(gòu)域蛋白SUN1、SUN2、SUN3、SPAG4能通過SUN結(jié)構(gòu)域與具有KASH結(jié)構(gòu)域的Nesprin-1，2，3等相互作用形成LINC復(fù)合物[1,7]，從而將細(xì)胞質(zhì)骨架與細(xì)胞核骨架有機(jī)的聯(lián)系起來。本研究證明了SUN蛋白家族的SPAG4L也能夠與具有KASH結(jié)構(gòu)域的Nesprin-3相互作用，形成新的LINC復(fù)合物。

目前蛋白質(zhì)相互作用研究的方法包括pull-down、Co-IP、酵母雙雜交和BiFC等技術(shù)[9]。本研究主要采用了Co-IP和BiFC技術(shù)。Co-IP實驗主要是通過免疫學(xué)的方法證明在細(xì)胞內(nèi)SPAG4L與Nesprin-3存在相互作用，這種相互作用可能是直接的也可能是間接的。BiFC實驗揭示，如果SPAG4L和Nesprin-3直接相互作用，那么就使得SPAG4L和Nesprin-3所帶的熒光蛋白的2個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團(tuán)而發(fā)熒光。如果不是直接相互作用，那么二者空間距離太遠(yuǎn)則不能發(fā)出熒光。

Chalmel 等[10]發(fā)現(xiàn)，小鼠Spag4L基因是減數(shù)分裂的標(biāo)志性基因，可能在精子發(fā)生減數(shù)分裂階段發(fā)揮著重要的生理作用。Zhu等[11]發(fā)現(xiàn)人SPAG4L(SUN5)基因發(fā)生復(fù)合突變會引發(fā)男性無頭精子癥，導(dǎo)致男性不育。以上研究表明，SPAG4L蛋白在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的生理功能，SPAG4L異常會導(dǎo)致男性不育的發(fā)生。據(jù)此，我們推測SPAG4L與Nesprin-3相互作用形成的LINC復(fù)合物可能是SPAG4L在精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用的分子機(jī)制之一。

Nesprin-3是含KASH結(jié)構(gòu)域的Nesprins家族成員，近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nesprin-3能夠與SUN1η相互作用，在精子頭部的形成中發(fā)揮著重要作用[12]。除了與SUN1η相互作用，Nesprin-3與SPAG4也能相互作用，例如在Spag4基因敲除的小鼠中，Nesprin-3定位發(fā)生改變，小鼠頭部和尾部結(jié)構(gòu)異常，出現(xiàn)雄性不育[6]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)SPAG4L與SUN1和SPAG4高度同源，尤其是SPAG4，兩者可能來自同一個起源。本研究結(jié)果顯示，SPAG4L也能與Nesprin-3相互作用，故而推測，SPAG4L與Nesprin-3形成的新的LINC復(fù)合物可能在精子頭部形態(tài)的維護(hù)以及尾部的發(fā)育方面具有重要的功能。

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(本文編輯：許曉蒙)

Investigation on the interaction of human testis protein SPAG4L with KASH domain protein Nesprin-3

RENYaoa,b,WUYongb,HUANGLi-huaa,XINGXiao-weia

(a.CenterforExperimentalMedicineResearch,b.DepartmentofClinicalLaboratory,theThirdXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410013,Hunan,China)

Objective To investigate the interaction of human testis sperm-associated antigen 4 like(SPAG4L) protein containing Sad, UNC-84(SUN) domain with nuclear envelop spectrin repeat proteins 3(Nesprin-3) containing Klarsicht, ANC-1 and Syne homology(KASH) domain. Methods SPAG4L protein domains were analyzed with the bioinformatics method. After the SPAG4L plasmid was transfected into Ntera-2 cells, the subcellular localization of SPAG4L was observed. The interaction of SPAG4L with Nesprin-3 was determined by immunofluorescence, co-immunoprecipitation(co-IP) and bimolecular fluorescence complementation(BiFC) technology, respectively. Results Bioinformatics analysis results showed that there was a transmembrane structure in SPAG4L protein. Subcellular localization results demonstrated that SPAG4L protein located in the nuclear membrane and cytoplasm. Immunofluorescence, Co-IP, and BiFC results showed that there was an interaction between SPAG4L and Nesprin-3, and that a LINC(linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton) complex was formed. Conclusion SPAG4L may interact with Nesprin-3 to form a LINC complex, which is important for understanding the function of SPAG4L protein in spermatogenesis.

sperm-associated antigen 4 like; nuclear envelop spectrin repeat proteins 3; interaction; LINC complex; spermatogenesis

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.18

國家自然科學(xué)基金項目(81170615)；湖南省衛(wèi)生廳項目(B2015-041)；中南大學(xué)研究生創(chuàng)新項目(2016zzts563)。

任瑤，1991年生，男，碩士研究生，主要從事分子診斷與基因功能研究。

邢曉為，副研究員，E-mail:davy2222@163.com。

R34

A

2016-12-30)