楊柯，歐劍鋒，白海，王存邦，潘耀柱，吳濤

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院血液科/血液病研究所，蘭州 730050)

CD55/CD59及嗜水氣單胞菌毒素變異體在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥患者中的表達*

楊柯，歐劍鋒，白海，王存邦，潘耀柱，吳濤

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院血液科/血液病研究所，蘭州 730050)

目的 探討CD55/CD59及嗜水氣單胞菌毒素變異體(FLAER)在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)患者中的表達水平。方法 用流式細胞儀檢測30例健康人對照及13例PNH患者外周血紅細胞和粒細胞表面抗原CD55/59缺失率，以及粒細胞和單核細胞FLAER缺失率。結(jié)果 PNH患者紅細胞CD55/59抗原缺失率(40.21±7.45，56.14±9.27)、粒細胞CD55/59抗原缺失率(55.52±13.40，72.63±16.26)、單核及粒細胞FLAER缺失率(83.60±11.92，87.37±10.53)均高于健康人對照組(P均<0.05)；PNH患者粒細胞CD55/59抗原缺失率明顯高于紅細胞，且在同種細胞中CD59缺失率亦高于CD55(P<0.05)；PNH患者粒細胞FLAER缺失率明顯高于粒細胞CD55/59抗原缺失率(P<0.05)。結(jié)論 CD55/59和FLAER在PNH患者中的缺失率較高，且在粒細胞中FLAER缺失率更高。

CD55/59；嗜水氣單胞菌毒素變異體；陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)患者細胞膜表面缺失糖化磷脂酰肌醇(GPI)錨連蛋白，易引發(fā)血管內(nèi)溶血和血紅蛋白尿[1]。GPI蛋白─CD55和CD59幾乎存在于所有的血細胞膜上，其發(fā)生缺失可作為PNH克隆存在的標志物，但CD55/59與錨鏈抗原特異性結(jié)合時抗原表達不穩(wěn)定，易受再生障礙性貧血(AA)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、自身免疫性疾病(ALPS)、溶血和細胞發(fā)育不全等因素的影響，診斷敏感性及特異性均不高[2]。嗜水氣單胞菌溶素前體變異體(FLAER)能特異性與細胞膜上GPI蛋白結(jié)合，不會產(chǎn)生因GPI蛋白種類和數(shù)量造成的誤差，且不受輸血和溶血影響，而具有更高的檢出率、敏感性和特異性[3]。但紅細胞表面某些糖蛋白的存在使FLAER不能很好與GPI錨蛋白結(jié)合，目前FLAER只用于粒細胞和單核細胞檢測[4]。本研究用流式細胞儀檢測PNH患者FLAER及CD55/59水平。報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集于2009年1月至2017年3月本院血液科臨床診斷為全血細胞減少患者226例，參照《血液病診斷及療效標準》[5]，PNH納入標準：(1)臨床表現(xiàn)符合PNH；(2)Ham試驗、糖水試驗，蛇毒因子溶血試驗、尿潛血(或含鐵血黃素)等項試驗2項以上陽性；(3)流式細胞術(shù)檢測外周血中CD55或CD59陰性中性粒細胞或紅細胞>10%。同時具備(1)+(2)或(1)+(3)條件即可納入病例組。排除標準：排除再生障礙性貧血、缺鐵性貧血、溶血性貧血和骨髓增生異常綜合征等疾病。最終確診為PNH患者13例，男9例，女4例，年齡34～76歲，中位年齡49歲，患者均無治療及輸血史。選擇同期于本院體檢健康者30例作為對照組，男18例，女12例，年齡22～69歲，中位年齡41歲。

1.2 儀器與試劑 FACS Canto Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司)；CD59-FITC、CD55-PE、CD33-PE、CD14-PE、CD45-Percp及相應(yīng)同型對照IgG2a、溶血素FACS Lysing solution 10×(美國BD公司)；嗜水氣單胞菌溶素前體變異體(FLAER-ALexa-488，美國Cedarlane公司)。

1.3 標本采集 采集各研究對象空腹靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，室溫靜置，1 h內(nèi)上機檢測。

1.4 流式細胞檢測 按照儀器操作規(guī)程及參考文獻[6]進行，并作適當(dāng)改進。

1.4.1 紅細胞CD55/59檢測 取2個空白試管，設(shè)為樣品管和對照管。樣品管中分別加入CD55-PE和CD59-FITC各20 L，對照管中分別加入IgG2a-PE和IgG2a-FITC各20 μL。取10 μL全血經(jīng)PBS洗滌后稀釋于1.5 mL PBS中，取100 μL分別加入2管中，充分混勻，室溫避光溫育30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液， PBS洗滌2次，0.5 mL PBS重懸后上機檢測。用FACS diva軟件在FSC/SSC散點圖上選定紅細胞群，最少獲取細胞數(shù)100 000，分別計算紅細胞CD55-和CD59-比例，同一標本重復(fù)檢測3次。

1.4.2 粒細胞CD55/59檢測 樣品管和對照管抗體處理步驟同1.4.1。取100 μL全血分別加入2管中，充分混勻，室溫下避光溫育30 min。各加入溶血素1 mL，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌2次，0.5 mL PBS重懸后上機檢測。FSC/SSC散點圖上選定粒細胞群，計算同1.4.1，同一標本重復(fù)檢測3次。

1.4.3 粒細胞和單核細胞FLAER檢測 設(shè)立對照管和樣品管1和2，對照管中分別加入IgG2a-PE、IgG2a-FITC、CD45-Percp各20 μL，樣品管1中加入CD14-PE、FLAER和CD45-Percp各20 μL，樣品管2中加入CD33-PE、FLAER和CD45-Percp各20 μL，CD45/CD33散點圖上選定粒細胞群，CD45/CD14散點圖上選定單核細胞群，最少獲取細胞數(shù)100 000，分別計算粒細胞、單核細胞FLAER-細胞比例，同一標本重復(fù)檢測3次。

2 結(jié)果

2.1 紅細胞和粒細胞CD55/59抗原缺失率檢測結(jié)果 與健康人對照組比較，PNH患者紅細胞和粒細胞CD55/59抗原缺失率均明顯增加(P<0.05)。見表1。PNH組中，粒細胞CD55/59抗原缺失的細胞比例明顯高于紅細胞(t分別為3.514，3.425，P均<0.05)。同種細胞上，CD59抗原缺失細胞比例亦明顯高于CD55(t分別為4.324，2.997，P均<0.05)。健康人對照及PNH患者粒細胞、紅細胞CD55/59流式檢測結(jié)果見圖1。

注：A～B，分別對粒細胞和紅細胞設(shè)門；C，健康人對照組粒細胞；D，健康人對照組紅細胞；E，PNH患者粒細胞；F，PNH患者紅細胞。

圖1 流式細胞術(shù)檢測粒細胞、紅細胞CD55/59抗原

2.2 粒細胞和單核細胞FLAER缺失率對比分析 PNH患者粒細胞和單核細胞FLAER缺失率明顯高于健康人對照組，見表1。而在PNH組中，粒細胞FLAER與單核細胞相比無顯著性差異(t=0.989，P=0.332)。粒、單細胞FLAER缺失率的流式檢測結(jié)果見圖2。

表1 各組CD55/59抗原及FLAER缺失率對比結(jié)果

2.3 粒細胞中CD55/CD59和FLAER缺失率檢測結(jié)果對比 結(jié)果表明，CD55/59抗原缺失率在粒細胞中明顯低于FLAER缺失率(t分別為7.125，5.299，P均<0.05)。

3 討論

馮玉虎等[7]研究表明，PNH患者CD55和CD59在紅細胞及粒細胞上的表達水平并不一致，CD55缺失率約為5%～10%，而CD59缺失率均>10%，本研究結(jié)果顯示，PNH患者同種細胞中，CD59抗原缺失細胞比例也明顯高于CD55，說明CD59比CD55具有更高的檢出率。楊容助等[8]認為，外周血粒細胞更新速度較快，不易受到輸血、溶血等因素影響，表達水平較為恒定，故其敏感性強于紅細胞，對PNH診斷價值更高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PNH組粒細胞CD55/59抗原缺失的細胞比例明顯高于紅細胞，分析原因可能是由于PNH最先累及的是粒細胞，其次才是紅細胞，而PNH患者紅細胞壽命普遍較短，發(fā)生嚴重溶血后，降低了GPI異?？寺〉募t細胞數(shù)量導(dǎo)致不易被檢測到。因此，對PNH患者來說，中性粒細胞的CD55/59檢測比紅細胞更有意義。

注：A～B，對單核細胞和粒細胞分別設(shè)門(綠色為中性粒細胞，紅色為單核細胞，藍色為淋巴細胞)；C，健康人對照組單核細胞(紅色細胞群)；D，PNH患者單核細胞；E，健康人對照粒細胞(綠色細胞群)；F，PNH患者粒細胞。

圖2 流式細胞術(shù)檢測單核細胞、粒細胞FLAER缺失率

FLAER特異表達于所有含GPI錨連蛋白的白細胞表面，理論上健康人白細胞系列抗原(CD45、CD14、CD15)和FLAER呈100%共陽性表達，利用CD45/CD15/CD24/FLAER進行單核細胞和粒細胞的PNH分析，可檢測到<0.1%的微量異?？寺?，檢出率可達100%[9]。Sutherland等[10]對536例疑似PNH患者進行FLAER與CD55/59對比檢測，發(fā)現(xiàn)用FLAER檢出63例(檢出率11.8%)，并且克隆數(shù)較大，不受溶血和輸血的影響；CD55/59檢出33例(檢出率6.2%)，檢測出的克隆數(shù)較小，容易受溶血和輸血的影響。本實驗中，對照組粒細胞FLAER比CD55/59具有更低的PNH克隆數(shù)，而PNH組粒細胞FLAER比CD55/59具有更高的PNH克隆數(shù)，表明與粒細胞CD55/CD59檢測相比，用FLAER直接檢測GPI蛋白，具有更高的PNH異?？寺〖毎麢z出率，在PNH診斷中具有更大的優(yōu)勢，與國內(nèi)其他文獻[3]報道的結(jié)果基本一致。但PNH為罕見病，本研究9年間僅收集到13例的PNH患者，更多的證據(jù)尚待以后積累。此外，本實驗中FLAER檢測主要應(yīng)用于存在明顯異常克隆的PNH患者，而缺乏對AA、MDS、ALPS、溶血性貧血等存在微量PNH克隆性疾病的對比實驗結(jié)果，尚不明確FLAER在這些患者中的檢出率、敏感性和特異性，也無法全面評價CD55/59和FLAER在所有全血細胞減少患者中的臨床診斷意義,今后仍需進一步研究證實。

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(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.06

國家自然科學(xué)基金(81372132)。

楊柯，1989年生，男，碩士，主要從事血液病流式檢測診斷工作。

白海，主任醫(yī)師，博士，E-mail:baihai98@hotmail.com。

R556.6+4, R446.62

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2016-11-23)