張曉燕 常婷 楊林 劉沙沙 李柱一

MG患者外周血Th17細(xì)胞與AChR抗體產(chǎn)生的關(guān)系研究

張曉燕 常婷 楊林 劉沙沙 李柱一

目的 探討重癥肌無力(MG)患者外周血中Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素17(IL-17)在MG發(fā)病中的作用。方法 收集40例MG患者和10名健康人(對(duì)照組)外周血標(biāo)本，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中Th17細(xì)胞比例，反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)PBMCs中維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γt(RORγt) mRNA水平，ELISA檢測(cè)血清中IL-17水平，放射免疫沉淀法檢測(cè)血清中抗乙酰膽堿受體抗體(AChR-Ab)滴度；分離PBMCs中CD4+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞與金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)系統(tǒng)中加入人IL-17和(或)IL-21中和抗體，放射免疫測(cè)定法檢測(cè)培養(yǎng)液中AChR-Ab滴度。采用MG評(píng)分(quantitative MG scoring system, QMGs)對(duì)MG的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)MG患者的Th17細(xì)胞比例、RORγt mRNA和 IL-17水平與病情QMGs的相關(guān)性，以及MG患者抗AChR-Ab滴度與PBMCs中Th17細(xì)胞比例的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果 MG患者PBMCs中Th17細(xì)胞比例〔1.11%(0.90%，1.34%)〕高于健康對(duì)照組Th17細(xì)胞比例〔0.26%(0.08%，0.36%)〕(z=5.494,P<0.001)，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.4394,P=0.0046)；血清中IL-17水平和PBMCs中RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)〔分別71.46(53.91,104.76)pg/mL、2.63(1.94,3.12)〕均較健康對(duì)照組〔分別18.82(12.73,29.80)pg/mL、1.13(0.98,1.28)〕顯著增高(均P<0.001)；MG患者血清中抗AChR-Ab滴度〔2.34(1.19,3.60)nmol/L〕較健康對(duì)照組〔-0.08(-0.24，-0.03)nmol/L〕顯著增高(z=4.662，P<0.001)，且與Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.7066，P=0.0001)。MG患者外周血T、B細(xì)胞與SEB共培養(yǎng)后抗AChR-Ab水平高于未加入SEB時(shí)及健康對(duì)照(均P<0.01)；加入抗人IL-21或IL-17中和抗體后，兩者AChR-Ab滴度與未加入抗體時(shí)AChR-Ab滴度比較均降低(均P<0.05)，且均仍高于MG患者未加入SEB時(shí)及健康對(duì)照(P<0.01)；在培養(yǎng)上清中同時(shí)加入抗人IL-21和IL-17中和抗體時(shí)AChR-Ab滴度明顯低于加入單種抗體時(shí)，而與未加入SEB時(shí)及健康對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)論 MG患者外周血中Th17細(xì)胞可能通過IL-17促進(jìn)AChR-Ab產(chǎn)生，參與疾病的病理過程。

重癥肌無力；Th17淋巴細(xì)胞；IL-17；膽堿能；抗體

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是主要累及神經(jīng)-肌肉接頭突觸后膜上煙堿型乙酰膽堿受體(AChR)的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，MG中約80% 是由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)介導(dǎo)[1]。目前觸發(fā)抗AChR-Ab產(chǎn)生的機(jī)制尚不明確。

輔助性Th17(T help，Th17)細(xì)胞是2005年發(fā)現(xiàn)的T輔助細(xì)胞(T help，Th)亞群，該群細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子IL-17，表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt)[2]。以往認(rèn)為Th17細(xì)胞主要參與細(xì)胞的炎性反應(yīng)[3]，近期發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞還參與了多種自身免疫性疾病的病理過程[4-5]。既往研究發(fā)現(xiàn)MG患者外周血中Th17細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-17水平均增高[6]，但Th17細(xì)胞在MG發(fā)病中的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過分析Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17在MG患者和健康對(duì)照外周血中表達(dá)的差異，研究Th17細(xì)胞及IL-17在MG患者致病性自身抗體產(chǎn)生中的可能作用及其機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 觀察對(duì)象 收集2012-05—2013-11在第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科首診確診MG患者40例。其中男17例、女23例，年齡3～78歲，平均年齡(38.60±16.04)歲，病程0.5～156個(gè)月，病程中位數(shù)(上、下四分位數(shù))為26.00(8.25，76.50)個(gè)月?；颊吲R床癥狀符合MG診斷[7]，即有波動(dòng)性的肌無力，呈晨輕暮重，持續(xù)活動(dòng)時(shí)加重，休息后減輕；膽堿酯酶抑制劑新斯的明試驗(yàn)陽(yáng)性；電生理檢查重復(fù)頻率電刺激(repetitive nerve stimulation，RNS)檢測(cè)低頻(3～5 Hz)衰減大于10%?；颊呔鶡o家族性遺傳病及其他自身免疫疾病病史。所有患者均進(jìn)行Ossermann分型，其中Ⅰ型12例，Ⅱ型15例，Ⅲ型7例，Ⅳ型6例。同期收集與MG患者年齡、性別相匹配的健康人10名作為對(duì)照組，其中男4名，女6名，齡年齡6～72歲，平均年齡(32.20±20.16)歲。所有受試者均簽署知情同意書，并經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)審批同意。

1.2 主要試劑和儀器 人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于MP Biomedicals公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Takara公司；抗人IL-17、β-actin單克隆抗體購(gòu)于Millipore公司；免疫磁珠購(gòu)于美天尼公司；抗人IL-17、IL-21中和抗體購(gòu)于sigma公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)于BD公司；熒光定量PCR儀購(gòu)于Bio-Rad公司；高速低溫離心機(jī)購(gòu)于Eppendorf公司。PCR引物由上海生工公司合成，包括RORγt上游引物5’-CTTGGTGTGGACTGAGATTGC-3’，下游引物5’-ACTGGAAGGATAGGGGGACA-3’；GAPDH上游引物5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’，下游引物5’-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells ，PBMCs)中Th17細(xì)胞比例：清晨空腹采集MG患者及健康對(duì)照每人靜脈血10 mL，提取血清凍存?zhèn)溆谩２捎肍icoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMCs。取2×106個(gè)PBMCs加入無菌48孔培養(yǎng)板中，分別加入PMA和離子霉素，37 ℃孵育30 min，加入莫能霉素培養(yǎng)5 h，洗滌后加入抗人CD3-APC 單克隆抗體和抗人CD8-PerCP-Cy5.5單克隆抗體，4 ℃避光孵育30 min，洗滌后Cytofix/Cytoperm試劑盒破膜 ，加入抗人IL-17-PE單克隆抗體，4 ℃避光孵育30 min，洗滌后使用 FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子檢測(cè)：采用RT-PCR檢測(cè)MG患者及對(duì)照組PBMCs中RORγt mRNA水平(以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的基因與GAPDH比值)；采用ELISA檢測(cè)血清中IL-17水平(pg/mL)。

1.3.3 采用放射免疫沉淀法檢測(cè)血清中抗AChR-Ab滴度：取外傷截肢患者的肌肉組織，使用低溫高速離心機(jī)離心提取AChR，加入MG患者及對(duì)照組血清，再加入125I標(biāo)記的α-BuTx充分混勻后4 ℃過夜；加入兔抗人γ-球蛋白IgG，混勻后4 ℃靜置2 h，4 ℃離心、洗滌后γ計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)，抗體滴度以nmol/L表示。比較兩組抗體滴度，并分析MG患者的抗AChR-Ab滴度與PBMCs中Th17細(xì)胞比例的相關(guān)性。

1.3.4 放射免疫測(cè)定法檢測(cè)體外培養(yǎng)T、B細(xì)胞抗AChR-Ab滴度：隨機(jī)選取MG患者和對(duì)照組各6例，使用細(xì)胞免疫磁珠分離PBMCs中CD4+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞共孵育7 d，共分為6組，分別為健康對(duì)照T細(xì)胞+B細(xì)胞，MG患者T細(xì)胞+B細(xì)胞，MG患者T細(xì)胞+B細(xì)胞+金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)，MG患者T細(xì)胞+B細(xì)胞+ SEB+抗人IL-17中和抗體，MG患者T細(xì)胞+B細(xì)胞+ SEB+抗人IL-21中和抗體，MG患者T細(xì)胞+B細(xì)胞+ SEB+抗人IL-17及IL-21中和抗體。通過放射免疫沉淀檢測(cè)培養(yǎng)上清中抗AChR-Ab滴度。

1.3.5 MG病情評(píng)估及相關(guān)性分析：根據(jù)MG評(píng)分(quantitative MG scoring system, QMGs)對(duì)疾病的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估[8]。對(duì)MG患者的Th17細(xì)胞比例、RORγt mRNA和 IL-17水平與病情QMGs進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析?；颊吣挲g及對(duì)照組年齡符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；其他數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)性分布，

以中位數(shù)(上、下四分位數(shù))表示。兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman法分析。以雙側(cè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Th17細(xì)胞比例、RORγtmRNA和 IL-17表達(dá) 結(jié)果見圖1、表1。MG患者PBMCs中Th17細(xì)胞比例、RORγt mRNA表達(dá)水平及血清中IL-17水平均高于對(duì)照組(均P<0.001)。

SSC-Height：側(cè)散射 圖1 MG患者和對(duì)照組PBMCs中Th17細(xì)胞比例比較(流式細(xì)胞術(shù))

2.2 兩組血清抗AChR-Ab滴度比較 MG患者血清中抗AChR-Ab滴度均高于對(duì)照組(P<0.001；表1)，且與PBMCs中Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0,7066，P=0.0001)。

2.3 不同抗體干預(yù)情況下MG患者外周血T、B細(xì)胞體外培養(yǎng)上清抗AChR-Ab水平變化 MG患者外周血T、B細(xì)胞加入SEB后共培養(yǎng)抗AChR-Ab水平高于未加入SEB時(shí)及對(duì)照組比較(P<0.01)；加入抗人IL-21或IL-17中和抗體后，兩者AChR-Ab滴度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與未加入抗體時(shí)AChR-Ab滴度比較均降低(P<0.05)，且均仍高于MG患者未加入SEB時(shí)及對(duì)照組(P<0.01)；在培養(yǎng)上清中同時(shí)加入抗人IL-21和IL-17中和抗體，AChR-Ab滴度明顯低于加入單種抗體時(shí)，而與未加入SEB時(shí)及對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

表1 MG患者與對(duì)照組PBMCs中Th17細(xì)胞比例以及外周血中RORγt mRNA、 IL-17和AChR-Ab水平比較 〔M(QL、QU)〕

A：對(duì)照組；B：MG患者；C：MG患者+金黃色葡萄球菌腸毒素B (SEB)；D：MG患者+SEB+IL-17中和抗體；E：MG患者+SEB+IL-21中和抗體；F：MG患者+SEB+IL-17中和抗體+IL-21中和抗體 圖2 不同干預(yù)下外周血CD4+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞共培養(yǎng)上清中AChR-Ab滴度變化(兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01)

2.3 病情嚴(yán)重程度與MG患者Th17細(xì)胞比例、RORγt mRNA和 IL-17水平的相關(guān)性 MG患者Th17細(xì)胞比例與QMGs呈正相關(guān)(r=0.4394,P=0.0046)。血清中IL-17水平與QMGs呈正相關(guān)(r=0.4350,P=0.0050)。RORγt mRNA表達(dá)水平與QMGs呈正相關(guān)(r=0.4047,P=0.0096)。

3 討論

MG是AChR-Ab介導(dǎo)的，細(xì)胞免疫依賴的，補(bǔ)體參與的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病。B細(xì)胞產(chǎn)生抗體需要T細(xì)胞的輔助作用，而在MG患者中Th細(xì)胞輔助B細(xì)胞產(chǎn)生AChR-Ab的作用機(jī)制尚不明確。

以往認(rèn)為Th2細(xì)胞可以輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體[9]，但I(xiàn)L-4缺陷的小鼠仍然能夠產(chǎn)生T細(xì)胞依賴的抗體。2008年發(fā)現(xiàn)了濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper cells ，Tfh)細(xì)胞，所分泌細(xì)胞因子主要是IL-21,認(rèn)為IL-21在輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體中發(fā)揮核心作用，但研究顯示在MG患者中使用IL-21中和抗體阻斷Tfh細(xì)胞的作用后仍有部分AChR-Ab產(chǎn)生[6]，因此本文作者推測(cè)在MG患者AChR-Ab產(chǎn)生的過程中存在其他Th細(xì)胞參與。Th17細(xì)胞是2005年發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，主要表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγt，所分泌細(xì)胞因子主要為IL-17，并通過IL-17來實(shí)現(xiàn)其生理及病理作用。最初研究認(rèn)為Th17細(xì)胞主要作用于細(xì)胞外病原菌及真菌，或參與慢性炎性反應(yīng)，之后發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞同時(shí)也參與了多種自身免疫性疾病的病理過程[10]。另有研究顯示在EAMG大鼠中Th17細(xì)胞增多，且大鼠肌無力嚴(yán)重程度與Th17細(xì)胞和IL-17水平呈正相關(guān)[11]；MG患者PBMCs中Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子均增高[6]。本研究顯示MG患者外周血Th17細(xì)胞比例、RORγt mRNA表達(dá)及血清中IL-17水平均較健康對(duì)照顯著增高，并且Th17細(xì)胞比例、IL-17 濃度和RORγt mRNA水平均與MG的嚴(yán)重程度(QMGs評(píng)分)呈正相關(guān)，與以往研究結(jié)果相符[12]，表明Th17細(xì)胞及IL-17參與了MG的病理過程，但其在MG發(fā)病中的作用機(jī)制尚不明確。

研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞中表面表達(dá)人趨化因子受體6((human chemokine receptor 6，CCR6)的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)趨化因子受體5(chemokine receptor 5，CXCR5)，而CXCR5是Tfh細(xì)胞表面的標(biāo)志物，它可以受趨化因子配體 13(Cxc Chemokine Ligand，CXCL13)趨化遷移到B細(xì)胞濾泡或生發(fā)中心(germinal center ，GC)，活化B細(xì)胞成為分泌抗體的長(zhǎng)壽漿細(xì)胞或記憶B細(xì)胞，因此推測(cè)Th17細(xì)胞也有輔助B細(xì)胞的功能。在BXD2小鼠的脾臟中Th17細(xì)胞通過IL-17促進(jìn)自發(fā)的GCs形成。在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental lyallergic encephalomyelitis，EAE)模型中Th17細(xì)胞可以誘導(dǎo)小鼠CNS內(nèi)形成異位的GC[13]。本研究中通過放射免疫沉淀方法檢測(cè)血清中抗AChR-Ab滴度，結(jié)果顯示MG患者血清中抗體滴度明顯高于健康對(duì)照組，并且與Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān)，表明MG患者外周血中Th17細(xì)胞與AChR-Ab的產(chǎn)生具有密切關(guān)系。為進(jìn)一步證實(shí)，本研究通過免疫磁珠分離出PBMCs中CD4+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞與SEB進(jìn)行共培養(yǎng)，并在培養(yǎng)體系中分別加入IL-21和(或)IL-17中和抗體，結(jié)果顯示MG患者T、B細(xì)胞與SEB共培養(yǎng)可以產(chǎn)生大量抗AChR-Ab，阻斷IL-21或IL-17作用后，AChR-Ab滴度雖顯著下降，但仍有部分抗體產(chǎn)生；但同時(shí)阻斷IL-17和IL-21的作用，培養(yǎng)系統(tǒng)中AChR-Ab滴度與健康對(duì)照比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明， Th17細(xì)胞可能在MG患者外周血中通過分泌IL-17輔助B細(xì)胞促進(jìn)AChR-Ab產(chǎn)生，從而參與疾病的病理過程，這可能也是MG患者致病性AChR-Ab產(chǎn)生的機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Th17可能參與了MG患者的病理過程，其主要作用是輔助B細(xì)胞產(chǎn)生致病性自身抗體AChR-Ab，提示通過研究Th17細(xì)胞和B細(xì)胞之間的相互作用可能為治療MG提供新的作用靶點(diǎn)。

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(本文編輯：鄒晨雙)

The circulating Th17 cells enhance AChR antibody production in myasthenia gravis patients

ZHANGXiaoyan,CHANGTing,YANGLin，LIUShasha,YANGKun,LIZhuyi*.

*DepartmentofNeurology,TangduHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’anShaanxiProvince710038,China

Li Zhuyi,Email: lizhuyi@fmmu.edu.cn

Objective To investigate the role of circulating Th17 cells and IL-17 in myasthenia gravis(MG). Methods Forty MG patients and 10 healthy controls(HC) were recruited. The proportion of Th17 cells in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) was detected via flow cytometry. The transcription factor RORγt mRNA expression in PBMCs was detected with Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). The concentration of cytokine IL-17 in sera was measured by ELISA. The anti-human AChR antibody in the serum was assayed using the radioimmunoprecipitation method. CD19+B cells and CD4+T cells were isolated from PBMCs of MG patients and healthy controls at the presence of SEB. The anti-AChR antibody secretion in T/B cells co-culture supernatant was detected by radioimmunoprecipitation. The effects of inhibiting IL-17 or IL-21 were examined by adding anti-IL-17 or IL-21 neutralizing antibody in the co-culture system. A quantitative MG scoring system (QMG score) was used to objectively evaluate the disease severity. Then, we analyzed the correlation between Th17 cells proportion, serum IL-17 level, RORγt mRNA and QMG scores. Results The percentage of Th17 cells increased significantly in PBMCs of MG patients compared with HC(P<0.0001), and Th17 cells counts was positively correlated with disease severity(r=0.4394,P=0.0046). Th17 cell-associated transcription factors RORγt mRNA and cytokines IL-17 expression elevated in MG patients(P<0.001). The titers of anti-AChR antibody(AChR-Ab)increased significantly in MG patients compared with HC(P<0.001), and the titer of AChR-Ab was positively correlated with disease severity. High level of anti-AChR antibody was detected in the co-culture of patients T and B cells . Blocking IL-17 or IL-21 alone by neutralizing antibodies led to a moderate decrease of anti-AChR antibody titer, while simultaneous blockage of IL-17 and IL-21 resulted in dramatically decrease of anti-AChR antibody titer.Conclusions In creased Th17 cell was involved in the pathological process of MG, and exacerbated its severity probably via enhanced AChR-Ab production.

myasthenia gravis; Th17 cell;IL-17; cholinergic; antibodies

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.02.008

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31270952)；甘肅省自然科學(xué)基金 資助項(xiàng)目(1506RJZA302)

730050中國(guó)人民解放軍蘭州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(張曉燕)；710038第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(常婷、劉沙沙、李柱一)；730000 中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)善后辦機(jī)關(guān)門診部(楊林)

李柱一，Email: lizhuyi@fmmu.edu.cn

R746.1

A

1006-2963(2017)02-0105-05

2015-12-16)