李偉 于澤謀 徐蕾 陳玉輝 王音 龔濤 黃一寧

兔高脂血癥與炎性反應(yīng)因子的關(guān)系

李偉 于澤謀 徐蕾 陳玉輝 王音 龔濤 黃一寧

目的 觀察高脂血癥與超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hsCRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)的關(guān)系，探討高脂血癥引起動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制。方法 將20只雄性清潔級(jí)新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常飲食組和高脂飲食組(HFD)，每組各10只。給予HFD組兔高脂飲食，給予正常飲食組正常喂養(yǎng)。于高脂喂養(yǎng)前以及高脂喂養(yǎng)后4、8、12周進(jìn)行血脂、hsCRP、TNF-α及ECP水平測(cè)定。結(jié)果 HFD組兔高脂飲食4周、8周、12周血清總膽固醇(t=6.59，t=10.93，t=17.88，均P=0.000)、低密度脂蛋白(t=6.59，t=10.86，t=15.07，均P=0.000)水平較正常飲食組增高，形成高脂血癥。與正常飲食組比較，4周、8周、12周時(shí)HFD組TNF-α(t=40.13，t=41.57，t=57.10，均P=0.000)及ECP(t=9.82，t=23.04，t=14.94，均P=0.000)水平升高。4周、12周時(shí)HFD組hsCRP水平較正常飲食組升高(t=5.62，P=0.025；t=2.40，P=0.029)。結(jié)論 高脂飲食可使兔血清炎性反應(yīng)因子hsCRP、TNF-α及ECP表達(dá)上調(diào)，高脂血癥可能通過(guò)促進(jìn)炎性反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

高脂血癥；嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白；炎癥因子；動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)性心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展受很多因素的影響，炎性反應(yīng)因子超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C reactive protein，hsCRP)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)被認(rèn)為參與了AS的慢性炎性反應(yīng)過(guò)程。最近研究表明，血清嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)水平升高與AS性冠心病(簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病)以及缺血性腦卒中的發(fā)生有關(guān)[1-2]。ECP是活化嗜酸性細(xì)胞釋放的強(qiáng)堿性蛋白中的重要組分，是嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)活化的重要標(biāo)志[3]。高脂血癥被認(rèn)為可能是AS的始動(dòng)因素，而AS病理表現(xiàn)為慢性炎性反應(yīng)的特征，提示高脂血癥可能與慢性炎性反應(yīng)有關(guān)。本研究利用高脂血癥動(dòng)物模型初步探討了高脂血癥與hsCRP、TNF-α及ECP的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)新西蘭大白兔20只，來(lái)自不同窩別，2.5月齡，體重2.5 kg左右。12 h晝夜(早晨7:00開(kāi)燈)，溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度40%±60%，單籠飼養(yǎng)(50 cm×40 cm×40 cm)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常飲食組(對(duì)照組)和高脂飲食(High fat diet，HFD)組，每組各10只。所有實(shí)驗(yàn)程序通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 喂養(yǎng)方案：于觀察期間，給予對(duì)照組大白兔標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)(0%膽固醇)，給予HFD組大白兔高脂飼料(1%膽固醇+6%大豆油)飼養(yǎng)。飲水不限。

1.2.2 血樣采集：分別于高脂喂養(yǎng)前(0周)以及喂養(yǎng)后4、8、12周末，禁食12 h后采集耳中動(dòng)脈血2.5 mL，采血時(shí)間為早晨08:30～10:00，室溫靜置30 min，置4℃以2200 g離心15 min，分離血清并分裝，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)：使用北京醫(yī)院檢驗(yàn)科Beckman全自動(dòng)生化分析儀對(duì)各時(shí)間點(diǎn)大白兔血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)進(jìn)行測(cè)定。采用增強(qiáng)速率透射比濁法測(cè)定血清hsCRP水平。采用兔TNF-α ELISA試劑盒(中國(guó)科諾迪生物科技公司)、兔ECP ELISA試劑盒(美國(guó)TSZ)分別測(cè)定兔血清TNF-α和ECP水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血脂水平比較 對(duì)照組和HFD組兔于實(shí)驗(yàn)前血清TC和LDL水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，于高脂喂養(yǎng)后4、8、12周，HFD組兔血清TC和LDL水平均明顯高于對(duì)照組(均P=0.000)。組內(nèi)不同喂養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)間比較，對(duì)照組和HFD組兔血清TC和LDL水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，對(duì)照組第12周TC、LDL水平高于實(shí)驗(yàn)前以及4、8周(均P<0.05)，HFD組高脂喂養(yǎng)4、8、12周TC和LDL水平均高于實(shí)驗(yàn)前(均P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 兩組白兔喂養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)血清TC水平比較 (n=10，±S，mmol/L)

注：TC：總膽固醇；HFD：高脂喂養(yǎng)，表2～5同；與組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP<0.05

表2 兩組白兔喂養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)血清LDL水平比較 (n=10，±S，mmol/L)

注：LDL：低密度脂蛋白；與組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP<0.05

表3 兩組白兔喂養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)血清hsCRP水平比較 (n=10，±S，mg/L)

注：hsCRP：超敏C反應(yīng)蛋白；與組內(nèi)實(shí)驗(yàn)前及8周分別比較，aP<0.05

表4 兩組白兔喂養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)血清TNF-α水平比較 (n=10，±S，ng/L)

注：TNF-α：腫瘤壞死因子α；與組內(nèi)實(shí)驗(yàn)前比較，aP<0.05

表5 兩組白兔喂養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)血清ECP水平比較 (n=10，±S，ng/L )

注：ECP：嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白；與組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比較，aP<0.05；與組內(nèi)實(shí)驗(yàn)前比較，bP<0.05；與組內(nèi)4、8周分別比較，cP<0.05

2.2 炎性反應(yīng)指標(biāo)

2.2.1 血清hsCRP水平：實(shí)驗(yàn)前對(duì)照組和HFD組血清hsCRP水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.432)，喂養(yǎng)后4、12周HFD組其水平高于對(duì)照組(均P<0.05)。對(duì)照組喂養(yǎng)不同時(shí)點(diǎn)hsCRP水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.300)，而HFD組不同喂養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)間hsCRP水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)，且喂養(yǎng)4、12周其hsCRP水平均低于實(shí)驗(yàn)前和喂養(yǎng)8周。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.2 血清TNF-α水平：實(shí)驗(yàn)前對(duì)照組和HFD組血清TNF-α水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.468)，其余各時(shí)點(diǎn)HFD組TNF-α水平均高于對(duì)照組(均P=0.000)。兩組不同喂養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較，對(duì)照組喂養(yǎng)后4、8、12周TNF-α水平均低于實(shí)驗(yàn)前(均P=0.05)，其余各時(shí)點(diǎn)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而HFD組喂養(yǎng)4、8、12周TNF-α水平分別高于實(shí)驗(yàn)前(均P<0.05)，其余各時(shí)點(diǎn)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.3 血清ECP水平：兩組實(shí)驗(yàn)前ECP水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各時(shí)點(diǎn)HFD組ECP水平均高于對(duì)照組(P=0.849)。組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間ECP水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，兩兩比較，對(duì)照組12周ECP水平分別低于其他時(shí)間點(diǎn)(均P<0.05)，其余各時(shí)點(diǎn)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，而HFD組高脂喂養(yǎng)4、8、12周ECP水平均高于實(shí)驗(yàn)前(均P<0.05)，且12周ECP水平低于4、8周(P<0.05)。

3 討論

AS是一種慢性炎性反應(yīng)性疾病，炎性細(xì)胞聚集、炎性反應(yīng)因子釋放在AS發(fā)生發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)起重要作用，而以LDL升高為特點(diǎn)的高脂血癥被認(rèn)為是這種慢性炎性反應(yīng)始動(dòng)和維持的基本要素。

本研究結(jié)果顯示，高脂飲食后HFD組兔血清TC、LDL水平顯著升高，表明高脂血癥兔實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒4-5]。不同時(shí)間點(diǎn)血脂比較，HFD組第4周、第8周及第12周之間TC、LDL水平比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示高脂喂養(yǎng)4周后即形成較穩(wěn)定的以高TC、高LDL為特征的血脂異常，其水平不隨高脂喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步增加。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組第12周TC及LDL較之前升高，可能與兔子生長(zhǎng)老化有關(guān)，也可能是由于樣本量偏小以及測(cè)量誤差等因素引起。

hsCRP是AS疾病重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因子和最有力的預(yù)測(cè)因子，不僅對(duì)未來(lái)心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)有很好的預(yù)測(cè)作用，還與疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)[6-7]。TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，由激活的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能通過(guò)促進(jìn)黏附分子表達(dá)、影響脂質(zhì)代謝、增加斑塊不穩(wěn)定性等途徑促進(jìn)AS疾病發(fā)生[8-10]。本研究結(jié)果顯示，HFD組hsCRP和TNF-α水平均較對(duì)照組明顯升高，而對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前TNF-α水平高于第4、8、12周，考慮與本文樣本量偏小以及測(cè)量誤差有關(guān)。

在眾多參與AS的炎性細(xì)胞中，EOS是其中一種。Sakai等[11]對(duì)冠心病患者血栓抽吸治療的組織樣本進(jìn)行組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在白色血栓和紅色血栓交界區(qū)觀察到EOS浸潤(rùn)，且浸潤(rùn)程度與血栓大小、紅色血栓占比呈正相關(guān)，認(rèn)為EOS可能通過(guò)促進(jìn)血栓生長(zhǎng)在冠狀動(dòng)脈閉塞中起重要作用。組織學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，EOS趨化因子在AS斑塊平滑肌細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)[12]。近年來(lái)，血EOS計(jì)數(shù)和EOS/白細(xì)胞比值被認(rèn)為是冠狀A(yù)S風(fēng)險(xiǎn)分層的新型生物標(biāo)志物[13]。遺傳學(xué)研究結(jié)果亦提示，EOS相關(guān)基因多態(tài)性與冠心病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[14]。上述研究均提示，在AS發(fā)病過(guò)程中可能存在EOS激活。

ECP是一種新型與AS有關(guān)的炎性反應(yīng)因子，由EOS分泌的強(qiáng)堿性蛋白，最先由Olsson等[15]于1972年從慢性粒細(xì)胞白血病患者的白細(xì)胞中分離，為富含精氨酸的單鏈鋅蛋白，具有3種糖基化形式，相對(duì)分子量為18000～22000，具有細(xì)胞毒性和免疫調(diào)節(jié)作用，是EOS活化、轉(zhuǎn)歸及參與炎性反應(yīng)的主要生物標(biāo)志[16]。研究表明血清ECP水平與多種炎性反應(yīng)性疾病的發(fā)生、發(fā)展及病情的嚴(yán)重程度有關(guān)，研究比較多疾病的有支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)血清ECP水平與AS相關(guān)性疾病有關(guān)。Niccoli等[17]研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者血清ECP水平明顯高于正常人群，認(rèn)為ECP是冠狀A(yù)S的新型生物標(biāo)志物。Byazrova等[18]研究進(jìn)一步證實(shí)了ECP水平還能反映冠心病的嚴(yán)重程度。高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)步，為疾病標(biāo)志物研究提供了新的手段，最近一項(xiàng)大樣本隊(duì)列研究對(duì)兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的隊(duì)列平均隨訪10年，利用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)共檢測(cè)了85種不同蛋白質(zhì)，尋找可用于預(yù)測(cè)缺血性腦卒中發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)志物，結(jié)果提示血清ECP水平升高與缺血性腦卒中的發(fā)生有關(guān)[19]。

本研究結(jié)果顯示，HFD組兔血清hsCRP水平、TNF-α水平均明顯高于對(duì)照組，提示高脂血癥可能作為始動(dòng)因子，促進(jìn)了炎性反應(yīng)因子的表達(dá)；HFD組兔血清ECP水平亦明顯高于對(duì)照組，提示ECP作為新型AS生物學(xué)標(biāo)記物，其水平的升高可能與高脂血癥有關(guān)，高脂血癥可能通過(guò)ECP途徑參與AS疾病的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，高脂血癥可能通過(guò)多種炎性反應(yīng)因子表達(dá)上調(diào)參與AS的發(fā)生與發(fā)展。各種炎性反應(yīng)細(xì)胞通過(guò)相關(guān)的細(xì)胞因子、細(xì)胞間黏附分子等炎性反應(yīng)因子相互關(guān)聯(lián)、相互作用，從而構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，形成級(jí)聯(lián)放大炎性反應(yīng)，共同促進(jìn)了AS的發(fā)展。新型AS生物學(xué)標(biāo)記物ECP能預(yù)測(cè)疾病發(fā)生，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，提示進(jìn)一步研究并評(píng)估其作為一種預(yù)后標(biāo)志和潛在治療靶標(biāo)具有重要意義。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

Objective To investigate the relationship between hypersensitive C-reactive protein (hsCRP), tumor necrosis factor-α (TNF-α), eosinophil cationic protein (ECP) and hyperlipidemia, and to explore the pathogenesis of atherosclerosis induced by hyperlipidemia. Methods Twenty male New Zealand white rabbits were randomly divided into normal diet group(n=10) and high fat diet;group (HFD,n=10). HFD group was fed by high fat diet, the control group was fed normally. Serum levels of hsCRP, TNF-α and ECP were measured at different time points before, 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks. Results Serum TC (t=6.59,P=0.000;t=10.93,P=0.000;t=17.88,P=0.000) and LDL (t=6.59,P=0.000;t=10.86,P=0.000;t=15.07,P=0.000) in the HFD group at 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks compared with those in the normal diet group, and hyperlipidemia was formed. Compared with the normal diet group, serum levels of TNF-α (t=40.13,P=0.000;t=41.57,P=0.000;t=57.10,P=0.000) and ECP (t=9.82,P=0.000;t=23.04,P=0.000;t=14.94,P=0.05) in the HFD group at 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks were increased. The hsCRP (t=5.62,P=0.025,t=2.40,P=0.029) level of HFD group was higher than that of the mormal diet group at 4 and 12 weeks. Conclusions The expression of inflammatory factors hsCRP, TNF-α and ECP are up-regulated after high-fat diet, and hyperlipidemia may be involved in the occurrence of atherosclerosis by promoting inflammatory response.

hyperlipidemia；eosinophil cationic protein；inflammatory factor；atherosclerosis

s：HUANG Yining，Email：ynhuang@sina.com；GONG Tao，Email：gb20598@sina.com

2017-01-09)

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.02.010

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271097)

北京大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(李偉、黃一寧)；北京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心(李偉、于澤謀、徐蕾、陳玉輝、王音、龔濤)

黃一寧，Email：ynhuang@sina.com；龔濤，E-mai：gb20598@sina.com

R743.3；R541.4

A

1006-2963(2017)02-0114-05

Study on the relationship between hyperlipidemia and inflammatory factors in rabbitsLIwei,YUZemou,XULei,CHENYuhui,WANGYin,GONGTao△,HUANGYining*.*DepartmentofNeurology,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China；△NeurologyDepartmentofBeijingHospital,NationalCenterofGerontology,Beijing100730,China