石萌　侯曉敏　劉宇　郭鵬美　宋奇穎　張明升

[摘要] 目的 觀察橙皮素（HSP）對大鼠離體心臟心功能的影響及其可能的機制。 方法 建立Langendorff離體心臟灌流模型，記錄不同濃度HSP對大鼠離體心臟冠狀動脈流量（coronary flow，CF）、心率（heart rate，HR）、左心室發(fā)展壓（left ventricular developed pressure，LVDP ）、左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、等容收縮期左心室內壓上升的最大速率（positive dp/dtmax，+dp/dtmax）、等容舒張期左心室內壓下降的最大速率（negative dp/dtmax，-dp/dtmax）的影響。使用鈣激活K+通道（KCa）阻斷劑四乙胺（TEA）、ATP敏感K+通道（KATP）阻斷劑格列本脲（Gli）、內向整流K+通道（KIR）阻斷劑氯化鋇（BaCl2）、電壓依賴性K+通道（KV）阻斷劑4-氨基吡啶（4-AP）等工具藥探究HSP對離體大鼠心臟心功能影響的機制。 結果 與用藥前相比，HSP可以增加離體大鼠心臟的CF值（P<0.05），降低其LVDP、+dp/dtmax值（P<0.05）。4-AP能抑制HSP對離體心臟CF、LVDP、+dp/dtmax的作用（P<0.05），而TEA、Gli、BaCl2無明顯作用（P>0.05）。 結論 HSP對離體大鼠心臟有負性肌力作用，其機制與心肌細胞的KV激活有關，與KCa、KATP、KIR無關。

[關鍵詞] HSP；離體心臟灌流；作用機制；KV通道

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）04-0032-05

Effects and mechanism of hesperetin on cardiac function in isolated rat hearts

SHI Meng HOU Xiaomin LIU Yu GUO Pengmei SONG Qiying ZHANG Mingsheng

Departmet of Pharmacology， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of hesperetin（HSP） on cardiac function in isolated rat hearts and explore its possible mechanism. Methods The model of Langendorff isolated heart perfusion system was used to record the results including coronary flow（CF）， heart rate（HR）， left ventricular developed pressure（LVDP）， leftventricular end-diastolic pressure（LVEDP）， positive dp/dtmax（+dp/dtmax） and negative dp/dtmax （-dp/dtmax）by different concentrations of HSP perfusion in isolated rat hearts. In this paper， the mechanism of effects of HSP on cardiac function in isolated rat hearts was explored by applying the inhibitors of KCa channel（TEA）， KATP channel（Gli），KIR channel（BaCl2）and KV channel（4-AP）. Results Compared with preadministration，HSP could increase the CF（P<0.05） and decrease the LVDP，+dp/dtmax（P<0.05） of isolated rat hearts. 4-AP could restrain the effects of HSP（P<0.05）， while TEA， Gli and BaCl2 had no obvious effects（P>0.05）. Conclusion HSP has a negative inotropic effect on isolated rat hearts，which could be related to the activation of KV channel on cardiomyocytes， but dont depend on KCa， KATP and KIR channel.

[Key words] HSP； Isolated heart perfusion； Mechanism； KV channel

橙皮素是一種黃烷酮類糖苷，主要來自柑橘屬植物果實的果皮和果肉。據文獻報道HSP具有顯著的抗炎[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]作用。流行病學研究顯示，在日常膳食中增加HSP的攝入可以有效地降低人類由于心血管疾病的死亡率[4]。研究表明，HSP可以通過JNK/Bax信號通路抑制脂多糖誘導的H9C2心肌細胞凋亡[5]，還可以通過阻斷PKCa/bⅡ-AKT、JNK和TGFb1-Smad信號通路抑制超壓力負荷小鼠的心臟重構[6]。以上研究成果均提示，HSP有望成為保護心血管系統(tǒng)的良藥。然而，HSP對正常心臟有何影響及其機制目前尚未有明確報道，本實驗通過建立Langendorff離體心臟模型，研究HSP對正常心臟的直接作用及其可能的作用機制，旨在為臨床應用HSP防治心血管疾病提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

橙皮素（HSP）、四乙胺（TEA）、格列本脲（Gli）、氯化鋇（BaCl2）、4-氨基吡啶（4-AP）、戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司，分析純氯化鈉（NaCl2）、分析純氯化鉀（KCl）購自天津市北辰方正試劑廠，分析純氯化鈣（CaCl2）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、磷酸氫鈉（NaHCO3）、氯化鎂（MgCl2）、二甲基亞砜（DMSO）購自生工生物工程（上海）股份有限公司，分析純葡萄糖、無水乙醇購自天津市大茂化學試劑廠。

用無水乙醇溶解HSP，DMSO溶解Gli，TEA、BaCl2、4-AP均使用三蒸水溶解。

1.2 實驗動物

成年雄性Spraguue Dawley （SD）大鼠80只，8周齡，體重為200～250 g，購自中國食品藥品檢定研究所，許可證號SCXK（京）2014-0013。

1.3 實驗儀器

恒溫水浴箱：HW-1000 超級恒溫水浴箱，購自成都泰盟科技有限公司；多通道數顯蠕動泵：LEAD-2-A，購自保定蘭格恒流泵有限公司；離體心臟灌流系統(tǒng)：GL-2，購自成都泰盟科技有限公司；生物信號采集系統(tǒng)：Power LabPS4/8、Lab Chart 7.0 pro，購自埃德儀器（上海）有限公司；計算機：DELL E520。

1.4 Langendorff離體心臟模型的建立

按照文獻所示方法[7]，大鼠稱重后，40 mg/kg戊巴比妥鈉經腹腔注射麻醉大鼠后，迅速開胸取心，置于4℃臺式液（配方為：NaCl2 118、KCl 5.0、CaCl2 1.5、NaH2PO4 1.2、NaHCO3 20、MgCl2 1.2、葡萄糖11，單位：mmol/L）中，迅速將心臟轉移固定到Langendorff灌流裝置上，以臺式液行主動脈逆行灌流。實驗過程中灌流液中持續(xù)通入95%O2+5%CO2混合氣，維持恒溫（37℃）、恒壓（75 mmHg， 1 mmHg=0.133 kPa），恒定pH（pH 7.4）灌流。待心臟恢復跳動后，用眼科剪在左心房上剪一小口，把通過腰麻管與換能器相連通的小球囊經過左心房置于左心室內，球囊內注入少量水，使心臟初始前負荷維持于4～10 mmHg。當實驗過程中出現嚴重的心律失常時舍棄該心臟8。

1.5 實驗分組

離體心臟隨機分為10組，每組8只。待心臟穩(wěn)定30 min后，可繼續(xù)實驗。（1）正常組：離體心臟持續(xù)灌注臺式液。（2）溶劑對照組：乙醇組和DMSO組，用含0.1%（V/V）的Vehicle或DMSO臺式液灌注心臟30 min。（3）藥物作用組：分別用HSP終濃度為10-5、3×10-5、10-4 moL/L的臺式液灌注心臟30 min，觀察不同濃度HSP對心功能的影響。（4）鉀通道阻斷劑+HSP組：分別用含四種鉀通道阻斷劑TEA、Gli、BaCl2、4-AP的臺式液（終濃度分別為1、0.01 、1、1 mmoL/L）預灌注心臟30 min，再用HSP終濃度為3×10-5 moL/L的臺式液灌注心臟30 min。

1.6 左心功能評價指標

心臟固定好后，經臺式液預灌注穩(wěn)定30 min后，采用LabChart 7.0 pro生物信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測記錄離體心臟心率（HR）、左心室發(fā)展壓（LVDP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、等容收縮期左心室內壓上升的最大速率（+dp/dtmax）、等容舒張期左心室內壓下降的最大速率（-dp/dtmax）等指標，在特定時間點記錄離體心臟冠狀動脈流量（CF）。以穩(wěn)定30 min末的值為基礎值，計算各指標的改變率。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用SPSS13.0軟件進行數據分析，計量資料以（x±s）表示，比較進行t檢驗或單因素重復測量方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 溶劑對大鼠離體心臟心功能及CF的影響

正常組與乙醇組、DMSO組各項數值之間差異無顯著性（P>0.05），各組給藥前后無顯著差異（P>0.05）（表1～6），表明溶劑對大鼠離體心臟心功能及CF無明顯影響。

2.2 不同濃度HSP對大鼠離體心臟心功能的影響

2.2.1 不同濃度HSP對大鼠離體心臟CF和HR的影響 HSP可以增加離體心臟的CF。隨著HSP濃度增加，離體心臟的CF值逐漸增大，最大值為（10.4±0.9）mL/min（表7）。HSP對離體心臟的HR無明顯影響（表8）。

2.2.2 不同濃度HSP對大鼠離體心臟左心室收縮功能（LVDP，+dp/dtmax）的影響 HSP可以濃度依賴性地降低離體心臟的LVDP，+dp/dtmax。隨著HSP濃度增加，離體心臟的LVDP，+dp/dtmax值逐漸降低，最小值分別為（50±3）mmHg、（1592±261）mmHg/s（表9、10）。

2.3 四種鉀通道阻斷劑對HSP灌流心臟的影響

與HSP 3×10-5 mol/L組相對比，用KV阻斷劑4-AP預處理心臟30 min后，4-AP可以顯著抑制HSP對離體心臟CF的增加，其增長率由（22.8±3.8）%降至（6.1±2.4）%（圖1A）；減弱HSP對LVDP的抑制作用，其抑制率由（26.8±4.7）%降至（5.9±5.6）%（圖1C）；減弱HSP對+dp/dtmax的抑制作用，其抑制率由（11.4±4.7）%降至（5.8±2.3）%（圖1D）（P<0.05）。而KCa阻斷劑TEA、KATP阻斷劑Gli和KIR阻斷劑BaCl2對HSP灌流心臟心功能的影響均不顯著（P>0.05）。

3 討論

多酚類包括黃酮類和單寧類。黃酮類是由兩個芳香環(huán)以及一個含氧雜環(huán)構成。根據結構以及中央雜環(huán)的氧化狀態(tài)，黃酮類又可以分為八種：黃酮類化合物、黃酮醇、黃烷酮、查爾酮、異黃酮、花色素類、橙酮類、雙黃酮類和新黃酮類聚合物。

研究發(fā)現，黃酮類可以降低缺血性腦卒中以及慢性血管性疾病的死亡率[9]。黃酮類具有顯著地心血管保護作用[10]，在心血管系統(tǒng)，黃酮類化合物影響膽固醇的內源性合成以及自由基的清除。在體外實驗中Havsteen BH[11]發(fā)現，黃酮類可以促進家兔主動脈內皮依賴性的舒張作用。有研究表明，枳類果實的黃酮類提取物可以通過NO-cGMP途徑舒張豬冠狀動脈[12]。HSP是柑橘屬二氫黃酮類中具有多種生物學活性的一種物質，在柑橘汁、橙汁、西柚汁等中含量豐富。我們的實驗表明HSP可以抑制心肌收縮功能并且可以舒張冠狀動脈。

Langendorff離體心臟模型廣泛應用于生理、藥理等領域的研究，其優(yōu)點是可以排除神經體液調節(jié)，從而研究某單一因素對心功能及代謝的影響。LVDP和+dp/dtmax反映了心臟收縮功能，+dp/dtmax可以間接地反映心肌的收縮速度[13]，本實驗結果顯示HSP可以降低正常大鼠離體心臟的LVDP、+dp/dtmax值，證明HSP對心臟收縮功能有抑制作用。LVEDP和-dp/dtmax反映了心臟舒張功能，-dp/dtmax可以反映左心室等容舒張期左心室內壓力最大下降速率以及左心室順應性[14]。CF可以一定程度上反應冠脈的收縮與舒張狀況，本實驗中HSP可以濃度依賴性的增加離體大鼠心臟的CF值，證明HSP對冠脈有一定的舒張作用，該結論本課題組前期15的研究結果相一致。HR也是反映心功能的一項重要指標，與心輸出量密切相關，此外，HR減慢可延長冠脈灌注時間，改善心肌血供。

在本實驗研究中，為了進一步探索HSP對心功能影響的機制，我們采用了四種K+通道抑制劑，實驗結果顯示HSP對心功能的影響可以被4-AP所阻斷，而不被TEA、Gli、BaCl2所影響，證明HSP對離體大鼠心臟的負性肌力作用可能與心肌細胞的KV激活有關，而與KCa、KATP、KIR無關。

Ca2+是肌細胞興奮-收縮耦聯的關鍵因子，由于心肌細胞的肌質網不發(fā)達，儲存的Ca2+較少，所以主要依賴外Ca2+通過肌膜及橫管膜中的L型鈣通道內流入胞質觸發(fā)興奮-收縮耦聯。KV通道的活性與心肌細胞靜息電位的形成，動作電位的時程與頻率尤其是動作電位復極相密切相關16。在心肌細胞動作電位2期，Ca2+通過L型鈣通道內流形成去極化電流，而這一內向電流則被KV外向電流所抗衡，當KV激活時，Ca2+內流減少，從而導致心肌收縮力減弱。我們的研究表明KV的激活的參與了HSP對心臟收縮功能的抑制。

綜上所述，HSP可以濃度依賴性地抑制心肌收縮功能，舒張冠狀動脈，其機制與KV激活有關，而與KCa、KATP、KIR無關。

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（收稿日期：2016-10-13）