陳群 石琴
[摘要] 目的 探討血清miR系列基因表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)預(yù)后的相關(guān)性。 方法 分別收集2010年4月~2013年4月收治的250例NSCLC患者冰凍組織和血清樣本,25例NSCLC及其癌旁組織,25例未經(jīng)手術(shù)治療的晚期NSCLC患者化療前和3個(gè)療程后的血清樣本,200例未經(jīng)任何抗癌治療的NSCLC患者血清,作為NSCLC組;選取100例健康志愿者的血清樣本,作為對(duì)照組。采用qRT-PCR方法檢測(cè)NSCLC組和對(duì)照組中血清miR系列基因表達(dá)水平,判斷血清miR系列基因表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 NSCLC組化療3個(gè)療程的患者的血清miR系列基因表達(dá)與化療前存在明顯差異(P<0.05);對(duì)照組的血清miR系列基因表達(dá)與化療前患者存在明顯差異(P<0.05),與化療后指標(biāo)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 血清miR系列基因表達(dá)水平在NSCLC患者明顯升高,治療后miR系列基因表達(dá)明顯下降,血清miR系列基因有可能成為預(yù)測(cè)NSCLC預(yù)后的分子標(biāo)志物。
[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌;miR系列基因;qRT-PCR法;基因表達(dá)
[中圖分類(lèi)號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701(2017)04-0016-03
Study on the correlation between the expression level of serum miR gene and the prognosis of non-small cell lung cancer
CHEN Qun SHI Qin
Department of Oncology, Fujian Medical University Teaching Hospital, Fuzhou Pulmonary Hospital, Fuzhou 350008, China
[Abstract] Objective To investigate the correlation between the expression level of serum miR gene and the prognosis of non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods Frozen tissues and serum samples from 250 patients with NSCLC from April 2010 to April 2013 were collected. The serum samples of 25 cases of NSCLC and its adjacent tissues, 25 patients with advanced NSCLC without surgery before the chemotherapy and after 3 courses treatment, and 200 patients with NSCLC without any anticancer treatment were selected as the NSCLC group. Serum samples of 100 healthy volunteers were selected as the control group. The levels of serum miR gene expression in NSCLC group and control group were detected by qRT-PCR method, and the relationship between the expression level of serum miR gene and prognosis was judged. Results The expression of serum miR gene in the patients in NSCLC group after 3 courses of chemotherapy was significantly different from that before the chemotherapy(P<0.05); the expression of serum miR gene in the control group was significantly different from that before chemotherapy(P<0.05), and there was no significant difference in the patients after chemotherapy(P>0.05). Conclusion Serum miR gene expression level is significantly increased in NSCLC patients. After the treatment, the expression of miR gene is decreased significantly. The serum miR gene may become a molecular marker for predicting the prognosis of NSCLC.
[Key words] Non-small cell lung cancer; miR gene; qRT-PCR method; Gene expression
非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是臨床上較為常見(jiàn)的惡性腫瘤,手術(shù)、放化療是治療非小細(xì)胞肺癌的主要手段,但非小細(xì)胞肺癌對(duì)術(shù)后輔助放、化療敏感性差[1,2]。而且評(píng)價(jià)化療后的效果,除常規(guī)指標(biāo),miR系列基因也被廣泛應(yīng)用作為評(píng)價(jià)NSCLC的臨床療效指標(biāo),可以反映化療后指標(biāo)的變化,從而確定化療效果。大部分學(xué)者關(guān)于miR系列基因與NSCLC預(yù)后的研究涉及其中的幾個(gè)指標(biāo),但是本研究涉及6個(gè)指標(biāo)miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1,因此可以更準(zhǔn)確地判斷?,F(xiàn)報(bào)道如下。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
分別收集2010年4月~2013年4月的250例NSCLC患者冰凍組織和血清樣本,并按期整理臨床治療資料,25例為NSCLC及其癌旁組織,收集其手術(shù)前和手術(shù)后2周的血清樣本;25例未經(jīng)手術(shù)治療的晚期NSCLC患者化療前和3個(gè)療程后的血清樣本;200例未經(jīng)任何抗癌治療的NSCLC患者血清,作為NSCLC組;選取100例與NSCLC組年齡性別分布相同的健康志愿者的血清樣本,作為對(duì)照組。兩組對(duì)象在性別和年齡方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 RNA分離提取 按照試劑說(shuō)明書(shū),組織total RNA抽提使用The miRVana miRNA Isolation Kit(Ambion,Austin,Texas,USA)。血清的total RNA 使用microRNAs Isolation Kit(Applied Biosystems,F(xiàn)orster City,CA,USA)抽提。total RNA溶于DEPC處理水中,-80℃保存。RNA濃度使用Nanodrop 2100(NanoDrop,Wilmington,DE)測(cè)定。
1.2.2 qRT-PCR分析 差異表達(dá)使用Two-step qRT-PCR分析。第一步cDNA的反轉(zhuǎn)錄,第二步 real-time quantitative PCR。miRNA的反轉(zhuǎn)錄相關(guān)操作嚴(yán)格按試劑盒One Step Prime Script?;microRNA cDNA Synthesis Kit(Takara,Tokyo,Japan)操作說(shuō)明進(jìn)行,反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為[3,4]:2×microRNA Reaction Buffer Mix 10 μL,0.1%BSA 2 μL,microRNA Prims Script?;RT Enzyme Mix 2 μL,Total RNA 1 μL,RNase Free ddH2O 5 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃ 60 min,85℃變性5 s。microRNA的qRT-PCR嚴(yán)格按照試劑盒SYBR & reg;Premix EX TaqTM Ⅱ(Takara,Tokyo,Japan)操作說(shuō)明進(jìn)行,qRT-PCR的反應(yīng)體系為SYBR?;Premix EX TaqTM Ⅱ 12.5 μL,PCR Forward Primer 1 μL,Uni-miR qPCR Primer 1 μL,模板2 μL,ddH2O 8.5 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火和延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。定量PCR使用ABI 7900的Fast real time PCR system(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)執(zhí)行,每個(gè)樣本平行重復(fù)3次,采用U6 snRNA 做參考基因,2-△△Ct method 用于計(jì)算基因表達(dá)倍數(shù)變化。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
數(shù)據(jù)分析使用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 兩組血清miR系列基因表達(dá)水平比較
見(jiàn)表1。NSCLC組化療3個(gè)療程患者的血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表達(dá)與化療前存在明顯差異(P<0.05);對(duì)照組血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表達(dá)與化療前患者存在明顯差異(P<0.05),與化療后患者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.2 不同病理NSCLC患者化療前后血清miR系列基因表達(dá)水平比較
見(jiàn)表2。不同病理NSCLC患者化療后血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表達(dá)與化療前比較存在明顯差異(P<0.05)。
3 討論
循環(huán)血miRNA對(duì)腫瘤早期診斷、腫瘤分期和預(yù)后效果等方面具有重要的警示作用,而且也可以很好地評(píng)價(jià)化療的效果[5,6]。大部分學(xué)者研究1個(gè)miRNA基因或2個(gè)可以在一定程度上評(píng)價(jià)腫瘤治療的效果,雖然血清中游離的miRNA 可能是來(lái)自裂解的腫瘤細(xì)胞,但也不能排除差異表達(dá)的miRNA是作為類(lèi)激素效應(yīng)而由其他器官炎癥引起的介導(dǎo)反應(yīng)[7,8]。所以在鎖定與肺癌預(yù)后有關(guān)的miRNA之前,有必要驗(yàn)證血清中游離的miRNA是否來(lái)源于病灶區(qū)域癌細(xì)胞的裂解。本課題同時(shí)利用組織和血清樣本檢測(cè)miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1表達(dá)水平,有助于提高篩選成功率。
研究[9,10]顯示miR-19a、miR-19b可以在膀胱癌、小泡狀橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌等腫瘤患者的血清中呈現(xiàn)高表達(dá),而且結(jié)果顯示miR-19a、miR-19b的表達(dá)與腫瘤血管的發(fā)生、預(yù)后、復(fù)發(fā)及其生存率具有密切關(guān)系。也有研究[11,12]顯示將miR-19a、miR-19b應(yīng)用于NSCLC患者的研究可以明顯出現(xiàn)高表達(dá),而且化療后明顯降低。外周血miR系列基因的穩(wěn)定性比較強(qiáng),不受外界環(huán)境及自身的生理狀態(tài)的影響,可以準(zhǔn)確地反應(yīng)人體自身的生理變化[13],因此外周血miR系列基因可以應(yīng)用于NSCLC診斷及預(yù)后的評(píng)價(jià)。本研究結(jié)果顯示化療前NSCLC患者存在明顯miR系列基因高表達(dá),而通過(guò)3個(gè)療程化療后患者的miR系列基因明顯降低,說(shuō)明miR系列基因可以評(píng)價(jià)NSCLC診斷及預(yù)后。
miR-17-3p、miR-18a、miR-20a和miR-92-1在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常[14,15]。而且在大多數(shù)惡性腫瘤中細(xì)胞或組織中,miR系列基因的表達(dá)均顯著升高。因此在腫瘤的診斷及治療中可以通過(guò)監(jiān)測(cè)患者的miR系列基因的變化可以判斷NSCLC患者的發(fā)病情況、化療后患者的康復(fù)情況,也可以作為判斷NSCLC患者預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究的結(jié)果也顯示miR-17-3p、miR-18a、miR-20a和miR-92-1在NSCLC患者化療前存在高表達(dá),而且通過(guò)化療后上述指標(biāo)明顯降低,說(shuō)明血清miR系列基因可以評(píng)價(jià)NSCLC患者的預(yù)后。因此本研究將NSCLC患者的預(yù)后與血清miR系列基因表達(dá)進(jìn)行研究,表明血清miR系列基因表達(dá)在NSCLC患者中的高表達(dá)。
綜上所述,血清miR系列基因表達(dá)水平在NSCLC患者明顯升高,治療后miR系列基因表達(dá)明顯下降,血清miR系列基因有可能成為預(yù)測(cè)NSCLC預(yù)后的分子標(biāo)志物。
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(收稿日期:2016-11-09)