孫海兵，張開光，李琴，劉應玲，陳思(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，合肥230001)

TRAIL逆轉人胃腺癌SGC7901/ADR細胞多藥耐藥的機制探討

孫海兵，張開光，李琴，劉應玲，陳思
(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，合肥230001)

目的 探討腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)對人胃腺癌阿霉素耐藥細胞(SGC7901/ADR細胞)多藥耐藥基因(MDR1)、多藥耐藥相關蛋白1(MRP1)、抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表達的影響，以明確TRAIL逆轉胃癌多藥耐藥的可能機制。方法 MTT法檢測SGC7901/ADR細胞和其親本細胞SGC7901對阿霉素、長春新堿、順鉑的藥物敏感性。實時熒光定量PCR法檢測SGC7901/ADR細胞和SGC7901細胞 MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA表達。不同濃度(10、50、100 ng/mL)TRAIL處理SGC7901/ADR細胞后，使用實時熒光定量PCR法、蛋白印跡法檢測各處理細胞和空白對照(未加TRAIL)細胞MDR1、MRP、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白的表達。結果 藥物敏感試驗顯示，與親本細胞SGC7901相比，長春新堿、阿霉素、順鉑對SGC7901/ADR細胞的IC50明顯提高(P<0.01或<0.05)。SGC7901/ADR細胞中MDR1、MRP1、Bcl-2的 mRNA表達量與親本細胞SGC7901相比上升，Bax mRNA表達量降低(P均<0.01)。TRAIL處理細胞后，下調了SGC7901/ADR細胞的MDR1、MRP1、Bcl-2 mRNA和蛋白的相對表達量，提高了Bax mRNA相對表達量，與空白對照相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。結論 TRAIL可能通過下調MDR1、MRP1、 Bcl-2和上調Bax的表達促進胃癌耐藥細胞的凋亡，進而部分逆轉胃癌的多藥耐藥。

胃腫瘤；腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體；多藥耐藥；細胞凋亡

胃癌是全球第五大最常見惡性腫瘤，也是癌癥死亡的第三大原因[1]。超過70%的胃癌病例發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。在胃癌治療中，化療仍是非常重要的療法，但多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象的產生常致使化療失敗。MDR的發(fā)展通常由一種或多種能量依賴性轉運蛋白介導，這種轉運蛋白可從細胞中發(fā)現(xiàn)并排出抗癌藥物[2]。這些轉運體包括P糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥基因(MDR1)、多藥耐藥相關蛋白1(MRP1)、肺癌耐藥蛋白和乳腺癌耐藥蛋白。除此之外，其他的機制也參與了腫瘤獲得性耐藥的發(fā)展，包括對藥物誘導凋亡的不敏感性[3]。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是一個能高度選擇性誘導腫瘤細胞凋亡而對正常細胞無損害的腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員之一。TRAIL可以提高化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，同時對腫瘤耐藥細胞也有較強的致凋亡作用，并可以將腫瘤耐藥細胞株逆轉為敏感細胞株[4]。研究表明，降低腫瘤細胞MDR1、MRP1表達，以及上調Bax/Bcl-2，可提高腫瘤對化療藥物的敏感性[5,6]，但TRAIL可否通過影響MDR1、MRP1和Bax/Bcl-2基因的表達而增加腫瘤對化療藥物的敏感性尚不明確。2016年3～12月，我們觀察了TRAIL對SGC7901/ADR 細胞中MDR1、MRP1、Bcl-2和Bax 表達的影響，旨在探討TRAIL殺傷腫瘤耐藥細胞及增加化療藥物敏感性的可能機制，為胃癌化療尋找新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌耐藥細胞株SGC7901/阿霉素(ADR)和親本細胞株SGC7901由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院全軍消化病研究所樊代明教授惠贈。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成，TRAIL蛋白購于Peprotech公司(美國)，TRIzol試劑購于Invitrogen公司(美國)，MTT購于Sigma公司(美國)，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit 購于Thermo公司(美國)，QuantiFast SYBR Green PCR Kit 購于Qiagen公司(德國)；小鼠抗人單克隆抗體MDR1、MRP1、Bcl-2購于圣克魯斯生物技術公司(美國)，兔抗人β-actin多克隆抗體購于BioWorld 公司(美國)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG購于北京中杉金橋生物技術有限公司。長春新堿(VCR)購于深圳萬樂藥業(yè)有限公司，順鉑(DDP)注射液購于南京制藥有限公司, ADR購于山西普德藥業(yè)股份有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) SGC7901細胞采用含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/mL的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。人胃腺癌耐藥株SGC7901/ADR在上述培養(yǎng)液的基礎上加入終質量濃度為1 μg/mL的ADR維持其耐藥性，于實驗前2周去掉ADR培養(yǎng)。在恒溫37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3 藥物敏感性試驗 采用MTT法。取處于對數(shù)生長期的SGC7901細胞和SGC7901/ADR細胞，以每孔1×104的細胞數(shù)接種于96孔板中，細胞貼壁后分別加不同濃度的ADR(SGC7901細胞的藥物濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL，SGC7901/ADR細胞的藥物濃度為0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL)、DDP(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL)、VCR(4、8、16、32、64、128、256 μg/mL)含藥培養(yǎng)液,常規(guī)培養(yǎng)48 h后每孔加入MTT 20 μL,接著孵育4 h,去除上清液，每孔加入150 μL DMSO,低速振蕩10 min,在免疫酶標儀波長490 nm處檢測各孔的吸光度(A)值。根據(jù)A值，計算出相應藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。實驗重復3次。

1.4 SGC7901和SGC7901/ADR細胞中MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA相對表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。收集處于對數(shù)期的SGC7901和SGC7901/ADR細胞，采用TRIzol試劑提取總RNA，具體實驗步驟根據(jù)試劑盒的操作說明進行。各組的總RNA濃度和純度用分光光度儀測定。取2 μg總RNA，按照FirstStrand cDNA Synthesisi Kit試劑盒的操作步驟，在PCR儀上將其逆轉為cDNA。MDR1上游引物：5′-GGAAGCCAATGCCTATGACT-3′,下游引物5′-GAACCACTGCTTCGCTTTCT-3′；MRP1上游引物5′-GATTCAGCCACAGGAGGTAGAGAGCA-3′，下游引物5′-ACTTCCACATCTGCTTCGTCAGTGG-3′；Bcl-2上游引物5′-GGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3′,下游引物5′-TACCCAGCCTCCGTTATCCT-3′；Bax上游引物5′-CCGATTCATCTACCCTGCTG-3′，下游引物5′-TGAGCAATTCCAGAGGCAGT-3′；β-actin上游引物5′-TTGCCGACAGGATGCAGAAGG-3′,下游引物5′-GCCGATCCACACGGAGTACTT-3′。以β-actin為內參照，使用QuantiFast SYBRGreen PCR Kit試劑盒，在ABI7500qPCR儀上進行擴增，反轉錄反應條件為42 ℃、1 h，70 ℃、5 min，4 ℃、10 min。PCR 擴增條件為95 ℃、5 min，95 ℃、10 s,60 ℃、34 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。

1.5 TRAIL作用后SGC7901和SGC7901/ADR細胞中MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA相對表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。收集處于對數(shù)期的SGC7901/ADR細胞，每孔2×105個細胞接種于六孔板中，細胞貼壁生長后，棄掉培養(yǎng)液，在SGC7901/ADR細胞中加入含有終質量濃度為10、50和100 ng/mL TRAIL的培養(yǎng)液，同時設置對照孔(未經TRAIL處理的SGC7901/ADR細胞)。加入TRAIL 48 h以后，收集上述各組處理細胞，然后參照1.4所述PCR方法進行操作。

1.6 TRAIL作用后SGC7901/ADR細胞中MDR1、MRP1、Bcl-2蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集處于對數(shù)期的SGC7901/ADR細胞，以每孔2×105個細胞接種在六孔板中，細胞貼壁生長后加入10、50、100 ng/mL TRAIL,并設空白對照。加入TRAIL 48 h后，使用預冷的PBS洗滌細胞2次以后，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min,收集，離心，取上清，用二辛可酸法測定蛋白的濃度，并且與上樣緩沖液4∶1混合，100 ℃煮沸，得到蛋白樣品可進行試驗或-80 ℃保存以備用。將樣品用12.5% SDS-PAGE 分離蛋白，電泳以后將蛋白轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶封閉，洗膜后在一抗稀釋液中，4 ℃反應過夜。洗膜后加入二抗[山羊抗鼠IgG(抗體稀釋比例為1∶50 000)]，室溫孵育2 h，再次洗膜后，加入ECL進行顯影。采用GE 公司(美國)的Image Quant LAS4000 數(shù)字成像系統(tǒng)顯影。用Quantity One 軟件分析目的蛋白和相對應的內參蛋白條帶灰度值。將空白對照設為1，計算出各處理細胞與空白對照的相對比值。β-actin用作內參照。

2 結果

2.1 體外藥物敏感性試驗結果 ADR、DDP、VCR對SGC7901的IC50分別為(0.531±0.028)、(0.656±0.050)、(4.487±0.303)μg/mL，對SGC7901/ADR細胞的IC50分別為(10.910±0.642)、(0.920±0.095)、(60.719±1.258)μg/mL；與SGC7901細胞相比，VCR、ADR、DDP對SGC7901/ADR細胞的IC50升高(P<0.01或<0.05)。

2.2 SGC7901/ADR細胞與SGC7901細胞MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量的比較 SGC7901/ADR細胞MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA的相對表達量分別為1.105±0.064、1.010±0.053、0.999±0.080、1.000±0.061，SGC7901細胞MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA的相對表達量分別為5 157.056±542.403、126.676±4.714、6.798±0.454、0.100±0.016。與SGC7901細胞相比，SGC7901/ADR細胞中MDR1、MRP1、Bcl-2 mRNA相對表達量增加(P均<0.01)，Bax mRNA相對表達量下降(P均<0.01)。

2.3 TRAIL對SGC7901/ADR細胞MDR1、MRP1、Bcl-2 mRNA相對表達量的影響 見表1。不同濃度TRAIL(10、50、100 ng/mL)作用細胞48 h后，與未加TRAIL處理的空白對照相比，MDR1、MRP1、Bcl-2 mRNA相對表達量降低(P均<0.01),Bax mRNA相對表達量增高(P<0.01)。

表1 TRAIL對SGC7901/ADR細胞中MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量的影響

注：與空白對照相比，aP<0.01。

2.4 TRAIL對SGC7901/ADR細胞MDR1、MRP1、Bcl-2蛋白表達量的影響 見表2。不同濃度TRAIL(10、50、100 ng/mL)作用細胞48 h后，與未經TRAIL處理的空白對照相比，MDR1、MRP1、Bcl-2蛋白表達量降低(P<0.05或<0.01)。

表2 TRAIL對SGC7901/ADR細胞中MDR1、MRP1、Bcl-2蛋白表達量的影響

注：與空白對照相比，#P<0.05,##P<0.01。

3 討論

化療在胃癌的治療中起著重要作用，然而MDR現(xiàn)象的產生是化療失敗的重要原因，因而制約了化療藥物在臨床的使用。MDR涉及大量和復雜的分子機制，包括增加藥物外排、細胞內藥物累積的再分布、藥物解毒作用的增加或者改變藥物靶分子、增強DNA損傷修復、抑制藥物誘導的凋亡等[7～9]。耐藥基因的激活和表達增加已經被證明與腫瘤的耐藥性有關。MDR1[10]和MRP1[11]已經被發(fā)現(xiàn)在調節(jié)胃癌的MDR中起著重要作用。與MDR1一樣，MRP1也屬于ATP合盒超家族，在MDR的發(fā)展中起著重要的作用。當腫瘤細胞高表達P-gp和MRP1時，許多化療藥物被從腫瘤細胞中排出。P-gp是第1個被發(fā)現(xiàn)的ABC轉運蛋白，由兩個跨膜結構域組成，每個跨膜結構域包含具有兩個細胞質核苷酸結合域的6個跨膜片段和1個磷酸腺苷共有基序。MRP1是第2個被發(fā)現(xiàn)的并且與P-gp具有相似結構域組織的ABC轉運蛋白，氨基酸的相似性僅限于兩個保守的ATP結合結構域[12]。本研究結果表明，與親本細胞SGC7901相比，SGC7901/ADR細胞中MDR1、MRP1的轉錄水平明顯增加，提示SGC7901/ADR細胞的耐藥性可能與MDR1、MRP1的高表達有關。

TRAIL是一個能高度選擇性誘導腫瘤細胞凋亡而對正常細胞無明顯損害的TNF超家族成員之一，這一特征使其在腫瘤治療方面有良好的應用前景。TRAIL對MDR細胞也有較強的致凋亡效應，可以增加MDR細胞對相關化療藥物的敏感性[4]。有研究表明，降低腫瘤MDR1、MRP1的表達可以增強腫瘤對化療藥物的敏感性[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL可以通過下調P-gp的表達來增加化療藥物對人白血病耐藥細胞株CEM/VBL的細胞毒作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL明顯下調了胃癌耐藥細胞SGC7901/ADR中MDR1、MRP1轉錄和翻譯水平的表達,表明TRAIL可能通過抑制MDR1、MRP1的表達進而逆轉胃癌MDR。

提高抗凋亡能力也是MDR的一種重要的機制。有研究表明Shugoshin1可通過抑制胃癌細胞的凋亡進而促進MDR表型的形成[13]?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax是兩個重要的內源性凋亡途徑的調控因子，有報道[6]指出Bcl-2可以在體內與Bax競爭并形成Bcl-2/Bax異源二聚體。Bax的同二聚體(Bax/Bax)在外膜中產生大孔，并通過促進細胞色素C的釋放進而促進凋亡，而Bcl-2/Bax的異源二聚體防止孔形成并抑制細胞凋亡,即Bcl-2/Bax降低，可以導致腫瘤細胞凋亡,相反，Bcl-2/Bax升高能夠抑制腫瘤細胞細胞凋亡，降低對藥物的敏感性。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與親本細胞SGC7901相比，SGC7901/ADR細胞中Bcl-2 在轉錄水平上表達升高，Bax則表達下降，說明SGC7901/ADR細胞中Bcl-2/Bax明顯增高，進而抑制細胞凋亡，因而可能參與MDR的發(fā)展。在胃癌耐藥細胞SGC7901/ADR中，使用TRAIL處理后，發(fā)現(xiàn)在轉錄和翻譯水平上TRAIL明顯下調了Bcl-2的表達，在轉錄水平上TRAIL上調了Bax基因的表達。表明TRAIL可能通過抑制Bcl-2和提高Bax的表達，即降低Bcl-2/Bax值，進而促進對胃癌耐藥細胞的致凋亡作用，從而逆轉胃癌MDR。

總之，TRAIL可能是通過下調耐藥基因MDR1、MRP1和抗凋亡基因Bcl-2的表達，以及增加促凋亡基因Bax的表達，增強了對腫瘤耐藥細胞的致凋亡作用，進而部分逆轉胃癌的MDR。TRAIL通過什么途徑下調胃癌耐藥細胞內MDR1、MRP1、Bcl-2表達以及上調Bax基因表達有待于下一步探討。

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Mechanism of TRAIL reversing multidrug resistance of human gastric adenocarcinoma SGC7901/ADR cells

SUNHaibing,ZHANGKaiguang,LIQin,LIUYingling,CHENSi

(AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

Objective To investigate the influence of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) on multidrug resistance gene (MDR1), multidrug resistance-associated protein (MRP1), anti-apoptotic gene Bcl-2 and pro-apoptotic gene Bax in human gastric cancer SGC7901/ADR cells and to explore the possible mechanism of TRAIL reversing multidrug resistance of gastric cancer. Methods The drug sensitivity of SGC7901/ADR cells and their parent cells SGC7901 to doxorubicin, vincristine and cisplatin was detected by MTT assay. The mRNA expression of MDR1, MRP1, Bcl-2, Bax gene of SGC7901/ADR and SGC7901 cells was detected by real-time fluorescence quantification PCR. SGC7901/ADR cells were treated with different concentrations of TRAIL (10, 50, 100 ng/mL). The real-time fluorescence quantification PCR and Western blotting were used to measure the expression of MDR1, MRP1, Bcl-2, Bax mRNA and protein of various genes in different treatment groups and the blank control group.Results MTT assay for drug sensitivity test showed that, compared with SGC7901 cells, the IC50of SGC7901/ADR cells to doxorubicin, vincristine and sisplatin was significantly increased (P<0.01 orP<0.05). Compared with SGC7901, the expression levels of MDR1, MRP1, Bcl-2 mRNA in SGC7901/ADR cells were significantly increased, but the expression of Bax mRNA was decreased (allP<0.01). The mRNA and protein expression levels of MDR1, MRP1 and Bcl-2 in SGC7901/ADR cells were down-regulated by TRAIL, and the expression of pro-apoptotic protein Bax mRNA was up-regulated. Compared with the blank control group, there were statistically significant differences (allP<0.05).Conclusion TRAIL may down-regulate the expression of MDR1, MRP1, Bcl-2 and up-regulate the expression of Bax to promote the apoptosis of gastric cancer drug-resistant cells, and reverse multidrug resistance of gastric cancer drug-resistant cells.

stomach neoplasms; tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; multidrug resistance; apoptosis

安徽省自然科學基金資助項目(1308085MH167)。

孫海兵(1992-)，男，碩士研究生，主要研究方向為胃癌耐藥機制探討。E-mail:sunhaibing9205@126.com

張開光(1966-)，男，教授，主要研究方向為胃腸道疾病的內鏡診治及胃癌耐藥機制探討。E-mail: zhangkaiguang0097@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.003

R735.2

A

1002-266X(2017)13-0009-04

2017-02-08)