張德保，邢春根 (蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，江蘇蘇州215000)

·論著·

長鏈非編碼RNA SPRY4-IT1 對結(jié)直腸癌細胞HT-29 增殖凋亡的影響及機制

張德保，邢春根
(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，江蘇蘇州215000)

目的 探討長鏈非編碼RNA(LncRNA) SPRY4-IT1對結(jié)直腸癌細胞HT-29增殖、凋亡的影響及機制。方法 采用qRT-PCR方法檢測LncRNA SPRY4-IT1在結(jié)直腸癌細胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)和正常腸上皮細胞(FHC)的表達。選擇其相對表達最高的HT-29細胞，以慢病毒載體介導(dǎo)構(gòu)建SPRY4-IT1過表達(上調(diào)組)和干擾的(下調(diào)組)穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，并設(shè)立無義轉(zhuǎn)染組和空白對照組；qRT-PCR檢測各組HT-29細胞中SPRY4-IT1 mRNA的表達量；CCK-8法檢測細胞增殖活力；克隆試驗檢測細胞的克隆形成率；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率和細胞周期。Western blotting法檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達量。結(jié)果 LncRNA SPRY4-IT1在結(jié)直腸細胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)相對FHC的表達增高，以HT-29細胞株中的表達最高(P均<0.05)。相對于空白對照組、無義轉(zhuǎn)染組，上調(diào)組SPRY4-IT1 mRNA表達量升高，HT-29細胞增殖活力增強，克隆形成率升高，凋亡率降低(P<0.05或<0.01)；而下調(diào)組SPRY4-IT1 mRNA表達量下降，細胞增殖活力減弱，克隆形成率降低，凋亡率升高(P<0.05或<0.01)；在各組細胞間，細胞周期分布比較，P均>0.05。相對于空白對照組、無義轉(zhuǎn)染組，上調(diào)組細胞Bcl-2蛋白表達量增多，Bax蛋白表達量減少(P<0.05或<0.01)；下調(diào)組Bcl-2蛋白表達量減少，Bax蛋白表達量增多(P均<0.01)。結(jié)論 LncRNA SPRY4-IT1可能通過促進Bcl-2表達，抑制Bax表達而促進結(jié)直腸癌細胞增殖、抑制其凋亡。

結(jié)直腸癌細胞HT-29；長鏈非編碼RNA；SPRY4-IT1；細胞增殖；細胞凋亡

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是指長度超過200個核苷酸，不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。早年研究認為，LncRNA是轉(zhuǎn)錄后的“暗物質(zhì)”或“噪音”[1,2]。近年研究證實，LncRNA雖不編碼蛋白質(zhì)，可以和蛋白質(zhì)相互作用[3]，并參與細胞分化過程的調(diào)節(jié)，在干細胞的生長、凋亡和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[4,5]。在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用的LncRNA有BRAF-actived LncRNA(BANCR)、LncRNA HOTAIR、LncRNA MALAT1、LncRNA-CCAT1等[6～9]。有研究表明，LncRNA SPRY4-IT1在黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤、食管癌、胃癌、腎透明細胞癌、膀胱癌中均有報道[10～15]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后具有一定的相關(guān)性。2016年5～12月，本研究主要探討了LncRNA SPRY4-IT1在結(jié)直腸癌細胞株中的表達，以及SPRY4-IT1對HT-29細胞增殖、凋亡的影響，為將來結(jié)直腸癌臨床分子靶向診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)和正常人腸上皮細胞(FHC)均購于中國科學(xué)院上海細胞庫。RPMI-1640、胎牛血清購自美國Gibco公司。SPRY4-IT1引物序列、內(nèi)參GAPDH引物購自上海生工。過表達和干擾序列由南京Abm公司合成。CCK-8試劑盒購自日本同仁；7-aad/PE試劑盒購自BD公司；細胞周期與細胞凋亡試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天；Bax、Bcl-2抗體(兔抗人)購自Abcam公司，β-actin內(nèi)參(鼠抗人)及抗兔、抗鼠二抗購自碧云天。BioRad CFX96 Touch 熒光定量PCR儀購自美國BioRad公司；TECAN Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀購自瑞士；恒壓恒流電泳儀購自美國Bio-RAD公司；電泳儀和電泳槽購自中國上海輝煌科學(xué)儀器公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自中國基因有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 用含10%已滅活的胎牛血清及1%青鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)直腸癌細胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)及FHC。根據(jù)培養(yǎng)基的顏色每2～3 d換液一次，待細胞融合至90%左右，進行細胞傳代，并取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 LncRNA SPRY4-IT1 mRNA的檢測 采用qRT-PCR法。TRIzol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR：所有cDNA樣品分別配制內(nèi)參和目的基因的實時定量PCR反應(yīng)體系。每個反應(yīng)管配置3個復(fù)孔，并設(shè)計陰性對照，即反應(yīng)體系中以去離子水代替模板cDNA。將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于qPCR儀上進行qPCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min預(yù)變性，然后按95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s(收集熒光信號)，72 ℃ 30 s,共45個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后設(shè)置熔解曲線分析程序。所用引物序列如下：SPRY4-IT1(上游引物：5′-AGCCACATAAATTCAGCAGA-3′，下游引物：5′-CGATGTAGTAGGATTCCTTTCA-3′);內(nèi)參GAPDH引物(上游引物：5′-GACTCATGACCACAAGTCCATGC-3′，下游引物：5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′)。采用2-ΔΔCT法分析LncRNA SPRY4-IT1的相對表達。

1.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建及分組 以慢病毒載體介導(dǎo)構(gòu)建SPRY4-IT1過表達、敲低及無義序列的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，慢病毒載體及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株由南京Abm公司合成并構(gòu)建。將細胞分為上調(diào)組(SPRY4-IT1過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株)、下調(diào)組(SPRY4-IT1敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株)及無義轉(zhuǎn)染組(無義轉(zhuǎn)染的細胞株)，設(shè)置空白對照組。干擾序列為：CCCAGATGTTGACAGCTGCCTCT。用qRT-PCR法檢測各組HT-29細胞中SPRY4-IT1的相對表達，方法和反應(yīng)條件同1.3。

1.5 細胞增殖活力的檢測 采用CCK-8法。取對數(shù)生長期胰酶消化懸浮細胞，調(diào)整細胞為104/mL,取100 μL加入96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每組細胞設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)陰性對照(只加培養(yǎng)基和CCK-8，沒有細胞)。分別于細胞接種到96孔板后的第1天至第5天加CCK-8液10 μL,于加液后繼續(xù)正常培養(yǎng)4 h，在酶標(biāo)儀上450 nm波長處測定每孔吸光度(OD)值。

1.6 細胞克隆形成能力的檢測 采用克隆形成試驗。取對數(shù)生長期各組HT-29細胞，胰酶消化細胞，培養(yǎng)基懸浮細胞，細胞計數(shù)板計數(shù)，用6孔板培養(yǎng)，每孔加300個細胞，加含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基至3 mL。細胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下，培養(yǎng)2～3周，3～5 d換液一次，觀察克隆形成，以肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，每孔加甲醇1 mL固定15 min。棄固定液，用姬姆薩染液染色30 min。每組細胞接種3個復(fù)孔。計算克隆形成率，克隆形成率=克隆數(shù)目/接種細胞數(shù)×100%。

1.7 細胞凋亡率及細胞周期的檢測 采用流式細胞術(shù)。細胞凋亡率的檢測：取對數(shù)生長期各組HT-29細胞，用胰酶消化，培養(yǎng)基懸浮,取1×105～5×105個細胞用PBS洗滌2次(1 000 r/min離心5 min),加Binding Buffer 100 μL懸浮細胞，每管中加7-aad 5 μL和PE染料5 μL，再加Binding Buffer 400 μL混勻。同時，設(shè)空白對照(不加染料)，單染管(分別用7-aad 5 μL和PE 5 μL染料)室溫避光反應(yīng)15 min。進行流式細胞凋亡率檢測，結(jié)果用總凋亡的百分比表示。細胞周期的檢測：取對數(shù)生長期各組HT-29細胞，用胰酶消化，培養(yǎng)基懸浮,取1×105～5×105個細胞用PBS洗滌2次(1 000 r/min離心5 min),棄上清，用PBS 0.5 mL重懸細胞， 70%乙醇5 mL固定，4 ℃過夜。1 000 r/min,離心15 min,棄上清，用PBS洗滌2次,棄上清，加緩沖液500 μL，加RNase 10 μL,37 ℃水浴30 min,加PI 25 μL,避光反應(yīng)30 min，進行流式細胞周期檢測。

1.8 各組HT-29細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達量的檢測 采用Western blotting法。取對數(shù)生長期各組HT-29細胞，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍，配制含抑制劑的蛋白抽提試劑(RIPA抽提試劑1 mL中加入蛋白酶抑制劑PMSF 10 μL),1×106～5×106個細胞,輕輕搖動5 min，用細胞刮將貼壁細胞刮下來，轉(zhuǎn)移細胞懸浮液至離心管中，12 000 r/min離心15 min，取上清，即為所提的蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA曲線計算目的蛋白濃度，5×蛋白上樣緩沖液SDS-PAGE 50 μL加目的蛋白200 μL，95 ℃煮沸5 min，-20 ℃保存或后續(xù)實驗。按比例配制12%分離膠和5%濃縮膠，根據(jù)目的蛋白濃度加上樣量，跑電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→孵一抗過夜→回收一抗→洗膜(10 min×4次)→孵二抗(1 h)→洗膜(10 min×4次)→ECL化學(xué)成像發(fā)光，觀察目的蛋白表達。用目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌細胞株和FHC中SPRY4-IT1 mRNA的表達量比較 FHC、HT-29、HCT-116、SW480、SW620、Caco-2細胞株中SPRY4-IT1 mRNA的表達量分別為1.00、36.76±7.98、4.49±0.38、19.88±4.88、15.46±3.30、8.81±1.81。相對于FHC，其他細胞中的表達均升高，以HT-29細胞株為著(P均<0.05)。

2.2 各組細胞中SPRY4-IT1 mRNA的表達量比較 上調(diào)組、下調(diào)組、空白對照組、無義轉(zhuǎn)染組SPRY4-IT1 mRNA的表達量分別為5.81±0.33、0.24±0.03、1.00、1.03±0.04，相對于無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組，上調(diào)組SPRY4-IT1 mRNA表達量升高(P均<0.01)，下調(diào)組SPRY4-IT1 mRNA表達量下降(P均<0.01)；無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組比較，P>0.05。

2.3 各組細胞增殖活力的比較 上調(diào)組、下調(diào)組、無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組第1、2、3、4、5天OD值分別為0.45±0.01、0.85±0.01、1.19±0.01、2.15±0.02、2.52±0.02，0.44±0.01、0.60±0.01、0.62±0.01、0.65±0.01、0.82±0.01，0.46±0.01、0.66±0.01、0.77±0.03、1.12±0.02、1.23±0.03，0.45±0.03、0.66±0.01、0.77±0.03、1.18±0.01、1.28±0.01。相對于無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組，除第1天外，其余各時間上調(diào)組細胞增殖活力增強(P均<0.01)，下調(diào)組細胞增殖活力下降(P均<0.05)；無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組比較，P均>0.05。

2.4 各組細胞克隆形成率比較 上調(diào)組、下調(diào)組、無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組克隆形成率分別為61.67%±2.91%、13.00%±1.16%、28.33%±1.76%、30.33%±1.67%。相對于無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組，上調(diào)組細胞克隆形成率升高(P均<0.01)，下調(diào)組細胞克隆形成率下降(P均<0.01)；無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組比較，P>0.05。

2.5 各組細胞凋亡率比較 上調(diào)組、下調(diào)組、無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組總凋亡率分別為0.69%±0.08%、3.34%±0.21%、1.60%±0.22%、1.29%±0.16%。相對于無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組，上調(diào)組細胞凋亡率降低(P均<0.05)，下調(diào)組細胞凋亡率升高(P均<0.01)；無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組比較，P﹥0.05。

2.6 各組細胞周期比較 上調(diào)組細胞在G0/G1期、S期、G2/M期所占百分比分別為77.20%±0.81%、6.93%±0.51%、13.76%±0.36%，下調(diào)組分別為71.41%±0.99%、12.86%±1.24%、13.53%±1.76%，無義轉(zhuǎn)染組分別為73.93%±1.20%、10.62%±1.01%、15.01%±0.60%，空白對照組分別為72.98%±0.44%、10.77%±0.46%、13.25%±0.44%。各組之間各期細胞所占百分比比較，P均﹥0.05。

2.7 各組Bcl-2、Bax蛋白表達量比較 上調(diào)組、下調(diào)組、無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組Bcl-2蛋白表達量分別為1.31±0.07、0.37±0.03、0.70土0.01、0.71±0.09，Bax蛋白表達量分別為0.51±0.01、1.42±0.05、0.82±0.01、0.71±0.02。相對于空白對照組、無義轉(zhuǎn)染組，上調(diào)組Bcl-2蛋白表達量增多(P均<0.01)，Bax蛋白表達量減少(P均<0.01)；下調(diào)組Bcl-2蛋白表達量減少(P均<0.05)，Bax蛋白表達量增多(P均<0.01)；無義轉(zhuǎn)染組、空白對照組比較，P均﹥0.05。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),LncRNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，影響腫瘤患者的治療及預(yù)后，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、遷移及凋亡等過程,但眾多LncRNA的生物學(xué)功能及其作用機制仍不是很清晰，需要進一步研究。LncRNA SPRY4-IT1是Sprouty4內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1，長度為687個核苷酸，其基因庫編碼：GC05M142318，位于5q31.3,源自于Sprouty4基因。Khaitan等[10]在2011年首次報道SPRY4-IT1在黑色素瘤細胞中的高表達，并調(diào)節(jié)黑色素瘤細胞的凋亡和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，SPRY4-IT1在結(jié)直腸癌細胞株HT-29中相對表達最高。上調(diào)HT-29細胞SPRY4-IT1的表達，促進細胞增殖和克隆形成，抑制其凋亡；而下調(diào)SPRY4-IT1的表達抑制HT-29的增殖和克隆形成，促進其凋亡。B淋巴細胞瘤-2基因簡稱Bcl-2,是細胞凋亡研究中最受重視的基因，它具有抑制凋亡的作用，此外Bcl-2可增強細胞對大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗作用；Bax是另一類與凋亡相關(guān)的蛋白因子，主要表現(xiàn)為促進細胞凋亡的作用。上調(diào)HT-29細胞SPRY4-IT1的表達，可促進Bcl-2的表達，抑制Bax表達，從而抑制了細胞凋亡；下調(diào)HT-29細胞SPRY4-IT1的表達，可抑制Bcl-2表達，促進Bax表達，從而促進了細胞凋亡。因此，我們認為SPRY4-IT1在結(jié)直腸癌細胞中表現(xiàn)為癌基因特性，敲低HT-29細胞中SPRY4-IT1的表達，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2能抑制結(jié)直腸癌細胞的生長和增殖，促進其凋亡，為將來結(jié)直腸癌臨床診斷和分子靶向治療提供理論依據(jù)，SPRY4-IT1有可能成為結(jié)直腸癌分子靶向治療重要靶點。

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Influence of long non-coding RNA SPRY4-IT1 on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells HT-29

ZHANGDebao,XINGChungen

(TheSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,China)

Objective To explore the influence and mechanism of long non-coding RNA (Lnc RNA) SPRY4-IT1 on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells HT-29. Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was performed to detect the expression of LncRNA SPRY4-IT1 in the colorectal cancer cell lines (HT-29, HCT-116, SW-480, SW-620, Caco-2) and the normal intestinal epithelial cell line FHC. We selected HT-29 cells with the relative highest expression of SPRY4-IT1 for this study. Lentivirus-mediated recombinant plasmid target SPRY4-IT1 was constructed and transfected into colorectal cancer HT-29 cells to establish the stably transfection cells of over-expression (up-regulation group) and interference (knock-down group). Meanwhile, the negative control group and blank control group were established. qRT-PCR was used to detect the expression of SPRY4-IT1 mRNA in HT-29 cells of each group. CCK-8 was applied to detect the proliferation of HT-29. cells Clone formation assay was used to test the colony forming efficincy of HT-29 cells. Flow cytometry was applied to detect the apoptosis and cell cycle of HT-29 cells. Western blotting was used to testify the expression of Bax and Bcl-2.Results The relative expression of LncRNA SPRY4-IT1 in colorectal cancer cell lines (HT-29, HCT-116, SW-480, SW-620, Caco-2) was significantly higher than that in the normal intestinal epithelial cell line FHC, and the expression of SPRY4-IT1 was the highest in HT-29 cells (allP<0.05). Compared with the negative control group and blank control group, the expression of SPRY4-IT1 mRNA, the proliferation and the colony forming efficincy of HT-29 cells in the up-regulation group were enhanced, and apoptosis rate was decreased (P<0.05 orP<0.01), and the opposite trend was observed in the knock-down group (P<0.05 orP<0.01). There was no significant difference in cell cycle of HT-29 cells among these groups (allP>0.05). Compared with the negative control group and blank control group, the expression of Bcl-2 was increased and Bax was decreased in HT-29 cells of the up-regulation group (P<0.05 orP<0.01), the expression of Bcl-2 was decreased and Bax was increased in HT-29 cells of the knock-down group (allP<0.01). Conclusion LncRNA SPRY4-IT1 may significantly accelerate proliferation and restrain apoptosis of colorectal cancer cell via promoting the expression of Bax and depressing the expression of Bcl-2.

colorectal cancer cells HT-29; long non-coding RNA; SPRY4-IT1; cell proliferation; apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項目(81672970)。

張德保(1979-)，男，碩士研究生在讀，主要研究方向為普外科胃腸道疾病。E-mail：18706202833@163.com

邢春根(1965-)，男，主任醫(yī)師(教授)，主要研究方向為普外科胃腸道腫瘤。E-mail:xingcg@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.001

R735.3

A

1002-266X(2017)13-0001-04

2017-01-12)