方 茜， 王文湘， 高美齡， 陽(yáng) 濤， 劉雅紅， 湯有志

(廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

取代基團(tuán)對(duì)含噻二唑片段截短側(cè)耳素衍生物抑制雞毒支原體活性的影響

方 茜， 王文湘， 高美齡， 陽(yáng) 濤， 劉雅紅， 湯有志

(廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

【目的】為研發(fā)抗雞毒支原體感染的藥物提供試驗(yàn)依據(jù)?！痉椒ā亢铣?8種C14支鏈含噻二唑片段的截短側(cè)耳素衍生物，采用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，通過(guò)體外藥敏試驗(yàn)研究所合成苯環(huán)取代基衍生物對(duì)雞毒支原體抑菌活性的影響。【結(jié)果】化合物12、15和17對(duì)雞毒支原體S6的最小抑菌質(zhì)量濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)均為0.125 0 μg·mL-1，化合物18和對(duì)照泰妙菌素對(duì)雞毒支原體S6的MIC值最高，均為0.015 6 μg·mL-1，化合物18氨基被苯甲酰基化后所得化合物17的抗菌活性減弱?！窘Y(jié)論】化合物18可作為候選化合物進(jìn)行深入研究，以開(kāi)發(fā)新的抗支原體感染藥物。

雞毒支原體； 截短側(cè)耳素衍生物； 噻二唑； 高分辨質(zhì)譜; 最小抑菌質(zhì)量濃度

感染雞毒支原體Mycoplasmagallisepticam而引起的慢性呼吸道病是危害禽類(lèi)的常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重影響著養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[1]，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，雞毒支原體感染雞群后，會(huì)導(dǎo)致雛雞弱雛率增加10%左右，蛋雞產(chǎn)蛋率下降10%～20%，肉雞體質(zhì)量減少38%，飼料轉(zhuǎn)化率降低21%，胴體質(zhì)量亦隨之下降，該病已成為嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的疾病之一[2]，而使用抗菌藥物是防治雞毒支原體病的一種重要手段[3]。由于雞毒支原體沒(méi)有細(xì)胞壁，所以對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢類(lèi)等抗菌藥不敏感，較為有效的抗菌藥有氟喹諾酮類(lèi)、泰樂(lè)菌素、紅霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、泰妙菌素、沃尼妙林等[4]。其中泰妙菌素等截短側(cè)耳素類(lèi)衍生物具有獨(dú)特的抗菌機(jī)理，不僅對(duì)雞毒支原體有很好的抑菌效果，而且不易產(chǎn)生耐藥性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床雞毒支原體病的防治。

截短側(cè)耳素是由 Kavanagh[5]于1951年從高等真擔(dān)子菌高側(cè)耳屬Pleurotusmutilus和P.passeckerinaus菌種培養(yǎng)分離得到的一種三環(huán)二萜類(lèi)化合物，其主體結(jié)構(gòu)由五元、六元和八元環(huán)駢合而成。因其獨(dú)特的抑菌機(jī)制，藥學(xué)工作者設(shè)計(jì)合成了大量新型截短側(cè)耳素衍生物用于抗菌藥物開(kāi)發(fā)[6]。截短側(cè)耳素的結(jié)構(gòu)修飾主要集中在C14位側(cè)鏈上[7]，C14位側(cè)鏈如果連接中性基團(tuán)或酸性基團(tuán)的化合物，則抗菌活性極低，連接2個(gè)堿性中心側(cè)鏈的衍生物其活性也較低，而連接1個(gè)堿性中心的硫醚基側(cè)鏈，其衍生物抗菌活性往往較好[8-9]?；卩邕颦h(huán)能增加多數(shù)抗菌藥物的活性，Ling等[10]設(shè)計(jì)合成了側(cè)鏈上含有噻唑環(huán)的截短側(cè)耳素類(lèi)衍生物，經(jīng)生物活性分析發(fā)現(xiàn)，其對(duì)臨床分離的MRSA(Methicillin-resistantStphylococcusaureus)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌均有良好的體外抑菌效果。Wang等[11]在截短側(cè)耳素C14側(cè)鏈上引入2-氨基噻唑得到系列衍生物，對(duì)一些革蘭氏陽(yáng)性耐藥菌的抗菌活性強(qiáng)于阿莫西林和泰妙菌素。Shang等[12]在C14位側(cè)鏈引入噻二唑雜環(huán)作為連接基團(tuán)，合成了大量截短側(cè)耳素衍生物，經(jīng)體外抑菌活性研究，發(fā)現(xiàn)其中具有氨基或叔胺基的化合物對(duì)MRSA、無(wú)乳鏈球菌具有較好的抗菌活性。但對(duì)抑制截短側(cè)耳素衍生物支原體活性的研究并不多見(jiàn)。

基于以上關(guān)于截短的工作側(cè)耳素衍生物的合成及活性研究，結(jié)合前人的研究成果[12-13]，本研究設(shè)計(jì)合成了C14支鏈引入噻二唑片段的18種截短側(cè)耳素衍生物，以高分辨質(zhì)譜對(duì)所合成化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，以雞毒支原體為研究對(duì)象，通過(guò)體外藥敏試驗(yàn)研究了所合成衍生物取代基團(tuán)對(duì)抑菌活性的影響，以期為新型高效截短側(cè)耳素類(lèi)動(dòng)物專(zhuān)用抗支原體感染類(lèi)藥物的研發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試驗(yàn)材料：截短側(cè)耳素原料、對(duì)甲基本磺酰氯、取代苯甲酰氯、2-氨基-5-巰基-1,3,4-噻二唑、吡啶、乙腈、異丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、硅膠板、無(wú)菌EP管、無(wú)菌豬血清、L-半胱氨酸、輔酶I、NaOH溶液、雞毒支原體菌株S6；儀器：磁力攪拌器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、紫外燈、循環(huán)泵、無(wú)菌超凈工作臺(tái)、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、LTQ-Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技公司，美國(guó))。

1.2 截短側(cè)耳素衍生物的合成

18種截短側(cè)耳素衍生物的合成在Shang等[13]、王波等[14]合成方法基礎(chǔ)上略作改進(jìn)，具體步驟為以對(duì)甲苯磺酰氯活化截短側(cè)耳C14支鏈上的羥基得對(duì)甲苯磺酰化截短側(cè)耳素，堿性條件下與2-氨基-S5-巰基-1,3,4-噻二唑反應(yīng)在截短側(cè)耳素C14支鏈引入噻二唑環(huán)，得到化合物18，最后再與苯環(huán)上有不同取代基的苯甲酰氯進(jìn)行?；磻?yīng)，得到化合物(1～17)(圖1)。所有產(chǎn)物經(jīng)柱色譜分離得到高純度的18種含有不同取代基的截短側(cè)耳素衍生物，18種化合物經(jīng)高分辨質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

1.3 藥敏試驗(yàn)

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 雞毒支原體培養(yǎng)基(pH7.8)：稱(chēng)取雞毒支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)基47.4 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，116 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至45 ℃左右加入150 mL無(wú)菌豬血清(豬血清56 ℃滅活30 min)，以及L-半胱氨酸0.125 g和還原型輔酶Ⅰ0.125 g，用無(wú)菌1 mol·mL-1NaOH溶液調(diào)pH至7.8左右。密封放4 ℃保存，于1個(gè)月內(nèi)使用。

1.3.2 雞毒支原體菌株S6的啟用 雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)株S6，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。取雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)株S6凍干粉接種于雞毒支原體液體培養(yǎng)基中，置于5%(φ)二氧化碳培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)4～6 d，當(dāng)培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)槌赛S色時(shí)，傳代2次，然后擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.3 抗菌藥原液的配制 分別稱(chēng)取0.025 6 g截短側(cè)耳素衍生物 1～18于10 mL容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺溶解,定容，使藥物質(zhì)量濃度均為2 560 μg·mL-1，同時(shí)按照相同的方法配制質(zhì)量濃度為2 560 μg·mL-1的泰妙菌素作為對(duì)照，用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，小管分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑及反應(yīng)條件：(ⅰ)對(duì)甲苯磺酰氯，吡啶，0 ℃，3 h，產(chǎn)率56.3%；(ⅱ) 2-氨基-5-巰基噻二唑，NaOH，0 ℃，2 h ; (ⅲ)乙酸乙酯，三乙胺，50～70 ℃，48 h。

圖1 截短側(cè)耳素衍生物的合成路線(xiàn)

Fig.1 The synthetic route of pleuromutilin derivatives

1.3.4 化合物最小抑菌質(zhì)量濃度的測(cè)定 采用2倍稀釋法每排雙面板取無(wú)菌2 mL EP管15個(gè)，每個(gè)編號(hào)的衍生物對(duì)應(yīng)1排雙面板。在第1管中加入0.9 mL液體培養(yǎng)基，其余各管加入0.5 mL，取配好的藥液0.1 mL加入第1管中充分混合后，取0.5 mL混合液加入第2管中，依此類(lèi)推，最后吸出0.5 mL棄去，然后每管中加入106CFU·mL-1的菌液0.5 mL，蓋好蓋子，得到化合物濃度依次2倍遞減的15個(gè)液體培養(yǎng)基。另作空白對(duì)照，37 ℃條件下培養(yǎng)，觀察雞毒支原體的生長(zhǎng)情況，以分析18種截短側(cè)耳素衍生物的最小抑菌質(zhì)量濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)確認(rèn)

因合成路線(xiàn)、原料確定，部分化合物經(jīng)過(guò)類(lèi)似的合成路線(xiàn)進(jìn)行合成，且已完成結(jié)構(gòu)表征[12-13]，本研究合成的18種截短側(cè)耳素衍生物僅由高分辨質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。以化合物18(C24H35N3O4S2)(圖2)為例，高分辨質(zhì)譜分析表明其精確質(zhì)量數(shù)理論值為494.214 2，所得化合物精確質(zhì)量數(shù)實(shí)測(cè)值為494.216 4，表明合成所得產(chǎn)物為目標(biāo)化合物。所有化合物精確質(zhì)量數(shù)如表1所示。

圖2 化合物18高分辨質(zhì)譜圖

2.2 最小抑菌質(zhì)量濃度

用試管2倍稀釋法，對(duì)18種截短側(cè)耳素衍生物及泰妙菌素進(jìn)行雞毒支原體抑制活性評(píng)價(jià)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 18種衍生物精確質(zhì)量數(shù)和18種衍生物及泰妙菌素對(duì)S6支原體MIC結(jié)果

1)苯環(huán)上不同取代基的苯甲酰氯。

由表1可知，化合物12、15及17對(duì)雞毒支原體的MIC為0.125 0 μg·mL-1，化合物1、3、4、6、13及16對(duì)雞毒支原體的MIC為0.250 0 μg·mL-1，化合物2、5、7～11及14對(duì)雞毒支原體的MIC為0.500 0 μg·mL-1，化合物18與泰妙菌素對(duì)S6雞毒支原體的MIC均為0.015 6 μg·mL-1。

3 討論與結(jié)論

截短側(cè)耳素衍生物與細(xì)菌核糖體50s亞基相互作用發(fā)揮抑菌作用，其C14支鏈能影響該類(lèi)化合物的抗菌活性[15]。本文結(jié)果顯示，C14支鏈引入噻二唑片段的截短側(cè)耳素衍生物18對(duì)雞毒支原體抑制活性最強(qiáng)，與泰妙菌素相當(dāng)?；衔?8氨基被苯甲酰基化后所得化合物17活性減弱，可能因化合物17中苯甲?；奈娮幼饔媒档土肃缍颦h(huán)上酰胺氮原子電子云的密度，減弱了化合物17中C14支鏈與核糖體50s亞基中堿基的相互作用進(jìn)而降低了化合物17的活性。而化合物1～11分子中的苯甲酰基上均有強(qiáng)吸電子基團(tuán)(氟、氯、硝基及三氟甲基)，與化合物17相比，分子中噻二唑及酰胺氮原子電子云密度進(jìn)一步降低，可能因此導(dǎo)致化合物1～11對(duì)雞毒支原體的抑制活性均弱于化合物17。Shang等[13]研究表明在化合物17苯環(huán)上引入氨基能增強(qiáng)目標(biāo)化合物對(duì)MRSA等的抑菌活性，鑒于氨基為給電子基團(tuán)，我們分別在17苯環(huán)上引入甲基和甲氧基這2種給電子基團(tuán)，以期增強(qiáng)目標(biāo)化合物抑制雞毒支原體活性，但所得化合物僅12及15與17抑菌活性相當(dāng)。與甲基及甲氧基相比，氨基除了具有給電子效應(yīng)外，還可能與核糖體上堿基存在強(qiáng)相互作用[12-13]，故而使含氨基衍生物抑菌活性得以增強(qiáng)。本研究并未合成苯環(huán)具有氨基取代的衍生物，因而在發(fā)揮抗支原體活性時(shí)，氨基是否仍具有這一特點(diǎn)尚需在進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究在截短側(cè)耳素C14支鏈上引入噻二唑片段，合成了18種截短側(cè)耳素衍生物，研究了取代基團(tuán)對(duì)衍生物抑制雞毒支原體活性的影響。化合物18對(duì)支原體的抑菌活性最強(qiáng)，與泰妙菌素相當(dāng)。Zhang等[16]研究表明化合物18以948.15 mg·kg-1劑量飼喂小鼠無(wú)明顯急性毒性；以5 mg·kg-1劑量連續(xù)28 d飼喂小鼠無(wú)明顯蓄積毒性，且其對(duì)MRSA感染小鼠的死亡保護(hù)率與泰妙菌素相當(dāng)。以上研究結(jié)合本試驗(yàn)中化合物18對(duì)S6支原體的體外抑菌結(jié)果表明，化合物18有望作為獸醫(yī)臨床抗雞毒支原體感染的候選藥物進(jìn)行進(jìn)一步研發(fā)。此外，本文所得18種化合物S6支原體抑制活性的構(gòu)效關(guān)系，可為C14支鏈含噻二唑截短側(cè)耳素類(lèi)衍生物的設(shè)計(jì)及后續(xù)研究提供依據(jù)。

[1] 馮元璋. 雞毒支原體感染及危害[J]. 中國(guó)家禽, 2008, 15(12): 45-47.

[2] 陳鳳梅，牛鐘相，程光民，等. 雞毒支原體研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2004, 25(3): 56-59.

[3] 紀(jì)新花，王永強(qiáng)，張新民. 雞支原體病的特點(diǎn)及防控策略[J]. 養(yǎng)禽與禽病防治, 2010(9): 34-36.

[4] 賈志江，劉娣琴，楊紅梅. 雞毒支原體感染的流行病學(xué)分析及綜合防制[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志, 2010, 29(3):117-118.

[5] KAVANAGH H R. Antibiotic substances from basidiomycetes: VIII:Pleurotusmultilus(Fr.) Sacc. andPleurotuspasseckerianusPilat[J]. P Natl Acad Sci USA, 1951, 37(9): 570-574.

[6] TANG Y Z, LIU Y H, CHEN J X. Pleuromutilin and its derivatives:The lead compounds for novel antibiotics[J]. Mini Rev Med Chem, 2012, 12(1): 53-61.

[7] 鄒懿，黃宇琪，胡昌華. 截短側(cè)耳素及其衍生物的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)抗生素雜志, 2009, 34(2): 65-68.

[8] SHANG R, WANG S, XU X, et al. Chemical synthesis and biological activities of novel pleuromutilin derivatives with substituted amino moiety[J]. PLoS One, 2013, 8(12): e82595.

[9] YI Y, YANG G, ZHANG C, et al. Synthesis and evaluation of novel pleuromutilin derivatives with a substituted pyrimidine moiety[J]. Eur J Med Chem, 2015, 101(13): 179-184.

[10]LING Y, WANG X, WANG H, et al. Design, synthesis, and antibacterial activity of novel pleuromutilin derivatives bearing an amino thiazolyl ring[J]. Arch Pharm, 2012, 345(8): 638-646.

[11]WANG X, LING Y, WANG H, et al. Novel pleuromutilin derivatives as antibacterial agents: Synthesis, biological evaluation and molecular docking studies[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2012, 22(19): 6166-6172.

[12]SHANG R, PU X, XU X, et al. Synthesis and biological activities of novel pleuromutilin derivatives with a substituted thiadiazole moiety as potent drug-resistant bacteria inhibitors[J]. J Med Chem, 2014, 57(13): 5664-5678.

[13]SHANG R, WANG G, XU X, et al. Synthesis and biological evaluation of new pleuromutilin derivatives as antibacterial agents[J]. Molecules, 2014, 19(11): 19050-19065.

[14]王波，李健，湯有志，等. 空間位阻對(duì)丁胺側(cè)鏈取代截短側(cè)耳素衍生物雞毒支原體抑制活性的影響[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2012, 39(12): 101-103.

[15]DAVIDOVICH C, BASHAN A, AUERBACH-NEVO T, et al. Induced-fit tightens pleuromutilins binding to ribosomes and remote interactions enable their selectivity[J]. P Natl Acad Sci USA, 2007, 104(11): 4291-4296.

[16]ZHANG C, YI Y, CHEN J, et al.Invivoefficacy and toxicity studies of a novel antibacterial agent: 14-O-[(2-amino-1,3,4-thiadiazol-5-yl)thioacetyl] mutilin[J]. Molecules, 2015, 20(4): 5299-5312.

【責(zé)任編輯 莊 延】

Influence of substituent groups on the antibacterial effect of pleuromutilinderivatives with thiadiazole moiety againstMycoplasmagallisepticum

FANG Xi, WANG Wenxiang, GAO Meiling, YANG Tao, LIU Yahong, TANG Youzhi

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Veterinary Drugs’ Research and Safety Evaluation/College ofVeterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 To provide experimental data for the research and development of new antibacterials againstMycoplasmagallisepticum.【Method】Eighteen analogues of pleuromutilin possessing thiadiazole moieties at the C14 chains were synthesized. High resolution mass spectrometry was used to verify the structures of the synthesized compounds. Influence of substituted benzene on the antibacterial effects of these pleuromutilin derivatives againstM.gallisepticumwere investigated byinvitrodrug sensitivity tests.【Result】The obtained MIC values revealed that analogues 12, 15 and 17 exhibited potential antibacterial activities againstM.gallisepticumS6 strain with MIC of 0.125 0 μg·mL-1. Analogue 18 and Tiamulin (control) showed the most potent antibacterial activities against S6 straininvitrowith MIC of 0.015 6 μg·mL-1. Analogue 17, which was the product from benzoylation of the amino group of analogue 18, had lower antibacterial activity compared with analogue 18.【Conclusion】 Analogue 18 can be used as a candidate compound for further development of antibacterials againstM.gallisepticum.

Mycoplasmagallisepticum; pleuromutilin derivative; thiadiazole moiety; high resolution mass spectrometry; minimum inhibitory concentration (MIC)

2016- 06- 21 優(yōu)先出版時(shí)間：2017-04-12

方 茜(1991—)，女，碩士研究生， E-mail：15989177877@163.com；通信作者：湯有志(1983—)，男，副教授，博士， E-mail: youzhitang@scau.edu.cn

廣東省自然科學(xué)基金(S2012030006590)；廣州市珠江科技新星專(zhuān)項(xiàng)(2014J2200042)

S852.62

A

1001- 411X(2017)03- 0021- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170412.1427.012.html

方 茜， 王文湘， 高美齡， 等.取代基團(tuán)對(duì)含噻二唑片段截短側(cè)耳素衍生物抑制雞毒支原體活性的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(3):21- 25.