李小波 周杰森 黃華瓊 毛立群

[摘要] 目的 研究COPD患者以及吸煙者BALF中SP-D的表達(dá)。研究香煙煙霧對Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞SP-D表達(dá)的影響以及激素對SP-D表達(dá)的調(diào)節(jié)。 方法 （1）實驗分為COPD組和對照組，根據(jù)是否有嗜煙史又將兩組各分為嗜煙組和不嗜煙組。各組患者行支氣管鏡檢查并行支氣管肺泡灌洗，檢測各組BALF中SP-D的表達(dá)。（2）培養(yǎng)人類Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系，分為對照組和香煙煙霧提取物組，對照組：細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。香煙煙霧提取物組：在培養(yǎng)液中加入香煙煙霧提取物培養(yǎng)。12 h 后檢測SP-D的表達(dá)，然后予地塞米松加入培養(yǎng)液中干預(yù)，72 h 后檢測培養(yǎng)液中SP-D的水平。 結(jié)果 COPD組患者BALF中SP-D較對照組表達(dá)明顯降低。COPD組中嗜煙組BALF中SP-D明顯低于不嗜煙組。對照組中嗜煙組BALF中SP-D明顯低于不嗜煙組。體外實驗表明，香煙煙霧提取物干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液中SP-D的表達(dá)較對照組明顯降低，而經(jīng)地塞米松處理后香煙煙霧提取物干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液中SP-D表達(dá)明顯增加，對照組經(jīng)地塞米松處理前后SP-D表達(dá)沒有明顯變化。 結(jié)論 COPD患者BALF中SP-D的表達(dá)明顯降低。嗜煙可明顯下調(diào)BALF中SP-D的表達(dá)。香煙煙霧提取物干預(yù)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中SP-D的表達(dá)明顯降低，激素對Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞SP-D的表達(dá)具有上調(diào)作用。

[關(guān)鍵詞] 肺表面活性物質(zhì)D；慢性阻塞性肺疾??；香煙煙霧；糖皮質(zhì)激素；支氣管肺泡灌洗液

[中圖分類號] R562.1+2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）08-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of SP-D in BALF in COPD patients and smokers， and to study the effects of cigarette smoke on the expression of SP-D in type II alveolar epithelial cells and the regulation of SP-D by hormone. Methods （1）The experiment was divided into COPD group and control group， and according to whether there was a history of smoking addiction， they were further divided into smoking addiction group and non-smoking addiction group. Bronchoscopy and bronchoalveolar lavage were performed in all groups. The expression of SP-D in BALF was detected.（2）Human type II alveolar epithelial cell line was cultured， and they were divided into control group and cigarette smoke extract group. Control group： Cells were cultured in serum-free medium. Cigarette smoke extract group： Cigarette smoke extract was added to the culture medium. After 12 hours， the expression of SP-D was detected， and then dexamethasone was added into the culture medium. After 72 hours， the SP-D level in the culture medium was detected. Results The expression of SP-D in BALF in COPD patients was significantly lower than that in the control group. In the COPD group， SP-D in BALF in the smoking addiction group was significantly lower than that in the non-smoking addiction group. In the control group， SP-D in BALF was significantly lower than that in non-smoking addiction group. In vitro experiments showed that the expression of SP-D in the cell culture medium in the cigarette smoke extract intervention group was significantly lower than that in the control group. The expression of SP-D treated with dexamethasone in the cell culture medium in the cigarette smoke extract intervention group was significantly increased. There was no significant change of SP-D expression in the control group before and after dexamethasone treatment. Conclusion The expression of SP-D in BALF was significantly lower in COPD patients. Smoking addiction could down-regulate the expression of SP-D in BALF. The expression of SP-D in type Ⅱ alveolar epithelial cell culture medium treated with cigarette smoke extract is significantly decreased， and hormone up-regulates SP-D expression in type Ⅱ alveolar epithelial cells.

[Key words] Surfactant protein D； Chronic obstructive pulmonary disease（COPD）； Cigarette smoke； Glucocorticoid；Bronchoalveolar lavage fluid

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的肺部慢性疾病，氣流受限不完全可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，它是呼吸系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，現(xiàn)階段我國約有2500萬COPD患者，每年約有100萬人死于COPD[1]。因此，鑒于COPD的高發(fā)病率，研究影響該疾病發(fā)生發(fā)展的干預(yù)因素，將具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。肺表面活性物質(zhì)替代治療在新生兒呼吸窘迫綜合征方面已經(jīng)取得了令人滿意的臨床效果。近期研究發(fā)現(xiàn)，肺表面活性物質(zhì)D（surfactant protein D，SP-D）在維持小氣道穩(wěn)定、減低氣道阻力方面亦起重要作用，并可從多方面參與氣道免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[2]。本研究通過研究嗜煙以及不嗜煙的COPD患者和正常人支氣管肺泡灌洗液（bronchi alveolar lavage fluid，BALF）中SP-D的表達(dá)，研究香煙煙霧提取物對人類Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌SP-D的影響以及激素對SP-D表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選擇2014年6月～2016年6月我院呼吸內(nèi)科住院及門診受試患者。COPD組：（1）入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)；②性別不限；③年齡45～65歲；（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①惡性腫瘤患者；②自身免疫疾病患者；③糖尿病患者；④艾滋病患者；⑤各種精神疾病患者。對照組：肺功能測定FEV1>70%、無肺部及其他系統(tǒng)疾病者。其中COPD組25例，根據(jù)有無嗜煙分為嗜煙組（14例）、不嗜煙組（11例）。所有病例均符合世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，吸入支氣管擴(kuò)張劑后FEV1/FVC<70%，支氣管舒張試驗陰性，同時本組患者符合以下指標(biāo)：Vmax50%<70%預(yù)計值，Vmax25%<70%預(yù)計值，F(xiàn)EF 25%～75%<70%預(yù)計值。所有病例均處于穩(wěn)定期。對照組17例，根據(jù)有無嗜煙分為嗜煙組（10例）、不嗜煙組（7例）。嗜煙組入選標(biāo)準(zhǔn)為：吸煙指數(shù)≥300支/年，吸煙指數(shù)=平均每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù)。

COPD組、對照組患者的性別、年齡比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見表1。

實驗所用Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞來源于A549系，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海），細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2研究方法

各組患者行常規(guī)電子支氣管鏡檢查，并予150 mL生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，回收率大于80%。

制備香煙煙霧提取物[4]（cigarette smoke extract，CSE）：將2支去過濾嘴香煙于一個注射器驅(qū)動裝置連接抽吸而燃著，10 min燃完，吸入的煙霧經(jīng)另一個出口通入50 mL無血清培養(yǎng)液中制成懸液，懸液用1 mol/L NaOH調(diào)至pH 7.4，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾備用，制備的香煙煙霧提取物在30 min之內(nèi)用于實驗。各組處理方法：（1）對照組細(xì)胞在無血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。（2）香煙煙霧提取物組細(xì)胞RPMI1640培養(yǎng)液中加入香煙煙霧提取物共同培養(yǎng)，模擬香煙對肺泡細(xì)胞的刺激作用。各組均在12 h 后留取部分培養(yǎng)液上清，-70℃保存。ELISA法檢測SP-D的表達(dá)。然后以地塞米松（DEX）2 μmol加入培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。72 h 留取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-70℃保存待檢。

1.3 觀察指標(biāo)

ELISA法檢測各組患者支氣管肺泡灌洗液以及細(xì)胞培養(yǎng)液中 SP-D 的表達(dá)水平。采用R&D公司試劑盒，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計量資料以（x±s）表示，同組治療前后比較采用配對t檢驗，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組支氣管肺泡灌洗液中SP-D的表達(dá)

COPD組患者支氣管肺泡灌洗液中SP-D表達(dá)明顯低于對照組，COPD組中嗜煙組支氣管肺泡灌洗液中SP-D低于不嗜煙組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組中嗜煙組支氣管肺泡灌洗液中SP-D低于不嗜煙組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液SP-D的表達(dá)

與對照組比較，香煙煙霧提取物組細(xì)胞培養(yǎng)液中SP-D表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。香煙煙霧提取物組經(jīng)地塞米松處理后細(xì)胞培養(yǎng)液中SP-D表達(dá)水平有明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而對照組經(jīng)地塞米松處理前后細(xì)胞培養(yǎng)液中SP-D表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

3 討論

肺表面活性物質(zhì)是由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和呼吸性細(xì)支氣管管壁上的Clara細(xì)胞合成和分泌的脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，其主要生理功能是降低肺泡表面張力，防止肺萎陷和肺水腫[5-7]。目前發(fā)現(xiàn)有4種表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白[8]，包括親水性的SP-A、SP-D和疏水性的SP-B和SP-C，SP-B和SP-C促進(jìn)磷脂在肺泡表面膜的形成，降低肺泡表面張力，而SP-A和SP-D主要參與調(diào)節(jié)肺部天然免疫防御作用[9]。肺表面活性物質(zhì)在生理情況下具有降低肺泡表面張力、抗水腫、穩(wěn)定小氣道、抗氧化和蛋白酶所致肺損傷、調(diào)節(jié)局部免疫和炎癥反應(yīng)等作用[10-12]。研究顯示，應(yīng)用外源性肺表面活性物質(zhì)進(jìn)行干預(yù)可改善COPD肺功能，明顯抑制氣道炎癥，減輕肺組織損傷，抑制吸煙及彈性蛋白酶對肺組織的損傷，保護(hù)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和分泌肺表面活性物質(zhì)的功能，對COPD的發(fā)生起到預(yù)防和保護(hù)作用[13-15]。肺表面活性物質(zhì)合成分泌障礙參與氣道阻塞發(fā)病過程，通過適當(dāng)補(bǔ)充外源性肺表面活性物質(zhì)或研制可能刺激內(nèi)源性肺表面活性物質(zhì)合成分泌的藥物，可能會開辟COPD新的治療途徑。

SP-D是肺表面活性相關(guān)蛋白的一種，對肺表面活性物質(zhì)維持正常的生理功能有重要作用，可與各種細(xì)菌，病毒和真菌相互作用，使病原體更容易被吞噬細(xì)胞吞噬[16]。研究證明，SP-D基因缺陷型老鼠容易產(chǎn)生肺部炎癥，引起局部巨噬細(xì)胞聚集以及基質(zhì)金屬蛋白酶水平升高，而且更易發(fā)生肺氣腫和肺損傷，可能與不能有效地清除壞死或凋亡細(xì)胞及它們的代謝物質(zhì)有關(guān)[17，18]。體外實驗表明，SP-D可與銅綠假單胞菌相互作用促進(jìn)清除，也可促進(jìn)對煙曲霉菌孢子的吞噬和殺傷，支氣管束中存在的肺表面活性物質(zhì)可通過減輕氣道壁萎陷及防止液橋形成等，在維持小氣道穩(wěn)定、減低氣道阻力等方面起重要作用[19，20]，可能在COPD發(fā)病中有重要作用。

吸煙是慢性阻塞性肺疾病的一個重要的危險因素，在體內(nèi)和體外的實驗均表明香煙的煙霧可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞壞死，而細(xì)胞壞死可能是肺組織破壞發(fā)展成肺氣腫的機(jī)制之一。有研究證明，COPD患者誘導(dǎo)痰中SP-D的表達(dá)可被明顯下調(diào)。本研究結(jié)果表明，COPD患者以及嗜煙者支氣管肺泡灌洗液中SP-D表達(dá)均明顯下降，這與有關(guān)學(xué)者對誘導(dǎo)痰SP-D的研究結(jié)果相一致。同樣，我們通過人類Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)實驗表明，在香煙煙霧提取物刺激下Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞SP-D的分泌明顯抑制，結(jié)果同我們的整體實驗結(jié)果不謀而合。通過地塞米松對細(xì)胞培養(yǎng)液中Ⅱ型肺泡細(xì)胞的干預(yù)表明，使用糖皮質(zhì)激素對香煙煙霧提取物干預(yù)組的Ⅱ型肺泡細(xì)胞的SP-D分泌具有明顯上調(diào)作用，表明糖皮質(zhì)激素有助于SP-D的合成，糖皮質(zhì)激素可通過上調(diào)SP-D表達(dá)這一機(jī)制而對COPD具有治療作用。

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