石 磊，朱絢麗，楊海生，陸 歡，洪玉萍，張?zhí)胰A，陳玲玲，官 兵*

（上海市第六人民醫(yī)院金山分院，上海 201599）

免疫組化雙染技術(shù)在肺及前列腺腫瘤活檢組織中的應(yīng)用

石 磊，朱絢麗，楊海生，陸 歡，洪玉萍，張?zhí)胰A，陳玲玲，官 兵*

（上海市第六人民醫(yī)院金山分院，上海 201599）

目的探討免疫組化雙染技術(shù)在肺及前列腺活檢組織中的應(yīng)用。方法采用Roche的雙染試劑盒，對(duì)35例肺活檢組織和29例前列腺活檢組織進(jìn)行免疫組化雙染/三染。結(jié)果肺活檢組織中，免疫組化雙染與單染的符合率為95%（19/20），其中腺癌為80%（4/5），鱗癌為92.9%（13/14），腺鱗癌100%（1/1）；前列腺腫瘤活檢組織中，免疫組化三染與單染的符合率為90%（18/20）。結(jié)論免疫組化雙染技術(shù)能對(duì)肺和前列腺惡性腫瘤進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，同時(shí)可解決活檢組織量少的問題。

免疫組化雙染；活檢；肺腫瘤；前列腺腫瘤

免疫組化雙染技術(shù)在于解決組織量少或難以獲取的活檢小標(biāo)本，不能同時(shí)進(jìn)行多張切片染色的問題；也可以進(jìn)行不同細(xì)胞群/亞群之間的比較（如T/B 淋巴細(xì)胞，CD5/ CD10，CD4/CD8，kappa/lambda）；更可以利用兩種抗體同時(shí)在一張玻片上顯示的特點(diǎn)，方便的對(duì)腫瘤良/惡性及浸潤/非浸潤鑒別診斷。

免疫組化雙染技術(shù)在科研領(lǐng)域的應(yīng)用已相對(duì)成熟，同時(shí)對(duì)臨床病理診斷也有很大的意義，它能有效解決穿刺組織樣本量少，無法做太多免疫組化進(jìn)行檢測(cè)的難題，也可通過各類指標(biāo)的合理搭配，提高診斷的準(zhǔn)確性。尤其在淋巴瘤診斷[1]及乳腺癌微小浸潤判斷上[2]的應(yīng)用價(jià)值，已經(jīng)得到臨床病理醫(yī)生的充分肯定。

但是免疫組化雙染技術(shù)在肺及前列腺癌中的應(yīng)用還不太普及，目前國內(nèi)僅有少數(shù)大醫(yī)院將雙染技術(shù)納入常規(guī)工作中，其原因可能在于手工操作存在技術(shù)上不穩(wěn)定，或者在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)各類指標(biāo)如何合理搭配還不是很明確等多重因素。因此，本研究以肺及前列腺活檢組織為研究對(duì)象，使用全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，對(duì)免疫組化雙染技術(shù)的條件進(jìn)行優(yōu)化，避免傳統(tǒng)手工操作中可能產(chǎn)生的誤差[3]，并探討其在肺和前列腺活檢組織及臨床病理診斷中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本收集

收集我院（上海市第六人民醫(yī)院金山分院）2012年～2015年肺癌和前列腺癌活檢組織標(biāo)本。10℅中性福爾馬林固定，石蠟包埋、常規(guī)切片和HE染色。

1.1.2 主要試劑

Ultra View Universal Alkaline Phospatase（Roche公司），Ultra View Universal DAB Detection Kit（Roche公司），HEMATOXYLIN II（Roche公司），BLUING REAGENT（Roche公司）。

1.2 方法

常規(guī)切片后，65℃烤片2 h。為達(dá)到實(shí)驗(yàn)流程的標(biāo)準(zhǔn)化，避免人工操作中的誤差，整個(gè)實(shí)驗(yàn)使用Ventana全自動(dòng)免疫組化機(jī)BenchMarkXT進(jìn)行雙染。染色后用表面活性劑清洗切片，再用不含二甲苯的中性樹膠常規(guī)封片，最后顯微鏡下讀片。為避免兩種抗體之間染色相互干擾，在第一種抗體顯色后，采用95℃烤片，對(duì)切片進(jìn)行高溫滅活，擬降低第二種抗體在顯色過程中的非特異反應(yīng)。另外，在封片時(shí)因紅染的顯色系統(tǒng)（Fast red）可溶于酒精，二甲苯等有機(jī)溶劑，所以我們采用了高溫烤干切片方式代替酒精脫水，并使用不含二甲苯的中性樹膠進(jìn)行封片，使切片在染色后可永久保存。

試驗(yàn)中使用TTF-1（Instance；Roche公司），Napsin A（Instance；Roche公司），CK5/6（Instance；Roche公司），P63（Instance；Roche公司）對(duì)肺癌活檢組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化雙染；使用34βE12（Instance；Roche公司），P63（Instance；Roche公司），P504S（Instance；Roche公司）對(duì)前列腺癌活檢組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化的雙染/三染。

2 結(jié) 果

本次課題中，我們用TTF-1，Napsin A和CK5/6及P63抗體對(duì)肺活檢標(biāo)本行免疫組化雙染。肺腺癌5例，1例因組織過少而導(dǎo)致染色失敗，其余4例TTF-1和Napsin A染色陽性，如圖一所示；肺鱗狀細(xì)胞癌14例，13例CK5/6和P63染色均陽性，如圖二所示；肺腺鱗癌1例，TTF-1，Napsin A和CK5/6及P63均顯示為陽性，如圖三、圖四所示。

圖1 肺腺癌TTF1細(xì)胞核(棕色)和Napsin A細(xì)胞漿（紅色）染色陽性（400×）。

圖2 肺鱗狀細(xì)胞癌P63細(xì)胞核(棕色)和CK5/6細(xì)胞漿（紅色）染色陽性（400×）。

TTF-1和Napsin A與單染的吻合率均為80%（4/5）；肺鱗狀細(xì)胞癌14例，13例CK5/6和P63染色均陽性，1例CK5/6陽性而P63陰性，CK5/6雙染與單染吻合率100%（14/14），P63雙染與單染的吻合率均為92.9%（13/14）。肺腺鱗癌1例，TTF-1，Napsin A和CK5/6及P63均顯示為陽性，與單染的吻合率為100%（1/1）。小細(xì)胞癌4例，TTF-1，Napsin A和CK5/6及P63均顯示為陰性。見表一。支氣管正常粘膜標(biāo)本10例，1例染色過程中發(fā)生了脫片，其余9例TTF-1和Napsin A染色均陰性，CK5/6和P63正常粘膜上皮染色均陽性。見表1。

圖3 肺腺鱗癌TTF1細(xì)胞核(棕色)和Napsin A細(xì)胞漿（紅色）染色陽性（400×）。

圖4 肺腺鱗癌P63細(xì)胞核(棕色)和CK5/6細(xì)胞漿（紅色）染色陽性（400×）。

本次課題中，我們用34βE12，P63和P504S對(duì)前列腺活檢標(biāo)本行免疫組化三染。前列腺腺泡腺癌20例，1例染色失敗，其余19例34βE12（0/19）和P63（0/19）染色陰性，18例P504S染色陽性，與單染的吻合率為90%（18/20）。如圖五所示。正常前列腺穿刺活檢組織9例，9例標(biāo)本34βE12和P63染色陽性，而P504S染色陰性，見表2。

圖5 前列腺腺泡腺癌中P504S細(xì)胞漿（紅色）染色陽性；殘存的正常腺體內(nèi)層上皮細(xì)胞34βE12細(xì)胞漿 (棕色)和外層肌上皮細(xì)胞P63細(xì)胞核（棕色）染色陽性（100×）。

表2 前列腺活檢組織中34βE12，P63，P504S的表達(dá)

3 討 論

肺癌的發(fā)病率從上世紀(jì)30年代開始迅速上升并在50年代成為男性癌癥死亡的首要原因，近年來在一些發(fā)達(dá)國家，女性肺癌發(fā)病率上升超過了男性[4]。肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌又分為鱗癌和腺癌，其中女性肺癌病理類型以腺癌居多，男性吸煙者以鱗癌多見[5]。對(duì)于不同類型的腫瘤，其治療方法有著明顯的不同。例如抗血管生成藥物貝伐單抗（阿伐斯?。┮蛟谥委熤幸鸬姆纬鲅枉[癌組織類型有關(guān)聯(lián)，是肺鱗癌的禁忌藥，又例如酪氨酸激酶抑制劑，是目前治療晚期腺癌的一線藥物[6]。所以準(zhǔn)確的鑒別肺癌的種類，能有效指導(dǎo)后續(xù)的治療，對(duì)病人的意義重大。前列腺癌同樣也是威脅男性健康的常見腫瘤之一，2002年全球新發(fā)病例679000例，位列男性腫瘤的第2位[7]。

前列腺的標(biāo)本多為穿刺標(biāo)本，存在著樣本量少（18號(hào)針?biāo)┑玫慕M織只有l(wèi) mm直徑），不能切過多的白片進(jìn)一步完成多項(xiàng)免疫組化的檢測(cè)。肺支氣管鏡活檢標(biāo)本也存在同樣的問題。而免疫組化在前列腺和肺腫瘤診斷中起著重要作用[8]，所以如何能在標(biāo)本量有限的前提下，盡可能多的得到免疫組化檢測(cè)指標(biāo)，使得病理醫(yī)生進(jìn)行精確診斷，是目前大部分病理科所面臨的挑戰(zhàn)。

在提高診斷精度以及提高檢測(cè)效率的雙重挑戰(zhàn)下，免疫組化雙染技術(shù)能有效的解決這些困難[9]，幫助病理醫(yī)生在平時(shí)診斷中提高準(zhǔn)確率。在本次實(shí)驗(yàn)中，肺腺癌TTF-1和Napsin A免疫組化雙染與單染的符合率為80%；鱗狀細(xì)胞癌CK5/6和P63免疫組化雙染與單染的符合率為92.9%；腺鱗癌TTF-1，Napsin A和CK5/6及P63免疫組化雙染與單染的符合率為100%。前列腺腺泡腺癌34βE12，P63和P504S免疫組化三染與單染的符合率為90%。因此我們認(rèn)為，免疫組化雙染/三染技術(shù)可有效解決肺和前列腺活檢標(biāo)本診斷精度和檢測(cè)效率的雙重挑戰(zhàn)。

總之，免疫組化雙染/三染技術(shù)能對(duì)肺和前列腺惡性腫瘤進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，同時(shí)可解決活檢組織量少的問題。

[1] 周航波,馬恒輝,饒 秋,等.T/B(CD3+CD20)淋巴細(xì)胞免疫組化雙染技術(shù)在淋巴瘤診斷中的應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2011,27(2):209-209.

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本文編輯：吳玲麗

Application of immunohistochemical double staining technique in biopsy of lung and prostate tumors

SHI Lei, ZHU Xuan-li, YANG Hai-sheng, LU Huan, HONG Yu-ping, ZHANG Tao-hua, CHEN Ling-ling, GUAN Bing
(Shanghai No.6 People's Hospital Jinshan Branch, Shanghai 201599, China)

ObjectiveTo investigate the immunohistochemical double staining technique used in lung and prostate biopsy.MethodsRoche double staining kit,35 cases of lung biopsy and 29 cases of prostate biopsy tissue by immunohistochemical double staining / three staining.ResultsLung biopsy,immunohistochemistry double staining and staining with the rate of 95% (19/20),including 80% adenocarcinoma,squamous cell carcinoma (4/5) 92.9% (13/14),100% adenosquamous carcinoma (1/1); prostate tumor biopsy,immunohistochemical staining and three single staining with the rate of 90% (18/20).ConclusionFree The double staining technique can accurately diagnose the lung and prostate cancer,and can solve the problem of less biopsy

Immunohistochemical double stain;Biopsy;Lung tumour;Prostate tumour

R361

A

ISSN.2095-8242.2017.08.1388.03

上海市金山區(qū)衛(wèi)生計(jì)生委面上項(xiàng)目（JSKJ-KTMS-2014-14）；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)醫(yī)學(xué)引導(dǎo)類科技項(xiàng)目（134119b2800）

官兵