姚利， 聶國(guó)輝， 蔡智， 陸興， 劉鳳安

論 著

Hedgehog信號(hào)通路中Shh與PCNA蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)及臨床意義

姚利， 聶國(guó)輝， 蔡智， 陸興， 劉鳳安

目的 研究鼻咽癌(carcinomaofnasopharynx，NPC)組織中Shh蛋白的表達(dá)以及與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化Elivision PIus二步法，檢測(cè)2009年3月至2014年1月北京大學(xué)深圳醫(yī)院收治的50例鼻咽癌和26例炎性鼻咽部黏膜組織中Shh和PCNA蛋白的表達(dá)。結(jié)果 Shh和PCNA在鼻咽癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均較鼻咽慢性炎癥組織陽(yáng)性表達(dá)率增高(均P<0.05)。鼻咽癌組織中Shh蛋白表達(dá)率與鼻咽癌臨床T分期，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；PCNA的表達(dá)與鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，但與其臨床分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。Shh表達(dá)與PCNA表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論 Shh蛋白表達(dá)與腫瘤的高增殖活性有關(guān)，檢測(cè)鼻咽癌組織中Shh及PCNA的表達(dá)有利于判斷鼻咽癌原發(fā)病灶浸潤(rùn)生長(zhǎng)程度和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，可為判斷鼻咽癌預(yù)后提供參考。

鼻咽癌； Shh蛋白； PCNA蛋白； 預(yù)后； 腫瘤標(biāo)記物

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞生長(zhǎng)有相似之處，一些在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化過(guò)程中起重要調(diào)控作用的Shh信號(hào)傳導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用[1]。研究表明，在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Shh通路的異常激活[2-3]。腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)Shh并以旁分泌方式激活鄰近細(xì)胞的信號(hào)通路，Shh信號(hào)通路在間質(zhì)微環(huán)境中的活化可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，但在鼻咽癌中其是否存在Shh通道的異常激活，他與癌細(xì)胞的增殖活性標(biāo)志物增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是否有關(guān)尚不清楚。本研究擬通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)hedgehog信號(hào)通路中Shh蛋白及PCNA在鼻咽癌的表達(dá)情況，以探討他們與鼻咽癌組織侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為評(píng)估預(yù)后提供新的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年3月至2014年1月北京大學(xué)深圳醫(yī)院鼻咽癌患者的病理石蠟包埋標(biāo)本50例，為鼻咽癌(carcinoma of nasopharynx，NPC)組。男38例，女12例；年齡20～71歲，平均年齡40歲；均為鼻咽非角化性癌，病理組織經(jīng)HE切片再次復(fù)檢確診；T1期10例，T2期21例，T3期14例，T4期5例；頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)轉(zhuǎn)移20例；患者均未接受過(guò)放射治療及化學(xué)藥物治療。對(duì)照組為同期活檢的慢性鼻咽黏膜炎性組織標(biāo)本26例，其中男16例，女10例；年齡19～68歲，平均年齡42歲。

1.2 免疫組化法 兔抗人多克隆抗體Shh購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，工作濃度1∶100。鼠抗人PCNA單克隆抗體、PCNA工作濃度為1∶50。Elivision Plus試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。所有的石蠟組織標(biāo)本連續(xù)切片，每張厚約5 μm。采用免疫組化Elivision Plus二步法，免疫組化染色程序按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用已知陽(yáng)性的肺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗和二抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 由兩位病理科醫(yī)生采用雙盲法進(jìn)行判定，Shh陽(yáng)性表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，陽(yáng)性顆粒粗細(xì)不等。PCNA主要表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒樣分布。顯微鏡下觀察，腫瘤細(xì)胞未著色或著色<10%為陰性(-)，腫瘤細(xì)胞著色11%～25%為陽(yáng)性(+)，26%～50%(++)，>51%(+++)，結(jié)果用百分率表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，蛋白表達(dá)相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Shh及PCNA蛋白在鼻咽組織中的表達(dá) 本組Shh蛋白在慢性炎性鼻咽黏膜組織中僅少數(shù)呈(+)表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為19.2%；在癌組織中呈(++～+++)表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率為58.0%。Shh蛋白在伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)中呈巢狀分布，腫瘤間質(zhì)細(xì)胞無(wú)染色，在不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)中呈散在分布，且隨著腫瘤臨床分期的增加，表達(dá)亦有增強(qiáng)的趨勢(shì)，見(jiàn)圖1～3。

PCNA陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕褐色細(xì)顆粒狀，范圍與細(xì)胞核等大，故核形狀清晰可見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)無(wú)染色。PCNA在慢性炎性鼻咽黏膜組織中僅少數(shù)呈(+)表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為34.6%，在癌組織中呈(++～+++)表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為76.0%。PCNA蛋白在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞核中呈(+++)表達(dá)，且癌旁組織多為(+)表達(dá)，在不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞核中呈(+～++)表達(dá)，見(jiàn)圖4～6。

Shh及PCNA蛋白在NPC和鼻咽炎性患者中的表達(dá)情況見(jiàn)表1，Shh蛋白及PCNA在NPC患者中表達(dá)均高于慢性鼻咽炎患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 Shh和PCNA的表達(dá)在NPC和鼻咽炎性組織中的比較(例)

2.2 NPC中Shh和PCNA的分布與NPC臨床T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 如表2、表3所示，Shh的表達(dá)與NPC的臨床T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；PCNA的表達(dá)與NPC臨床T分期無(wú)關(guān)(P>0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。

表2 Shh和PCNA表達(dá)在NPC不同臨床T分期中的比較(例)

表3 Shh和PCNA的表達(dá)在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC中的比較(例)

2.3 NPC中Shh及PCNA表達(dá)相關(guān)性Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，Shh蛋白與PCNA蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 NPC中Shh表達(dá)與PCNA表達(dá)的關(guān)系

3 討論

Nüsslein-Volhard等[4]于二十世紀(jì)八十年代首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)了hedgehog(HH)基因，認(rèn)為在人體胚胎發(fā)育中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化的作用。而在人類基因組中，HH基因具有3個(gè)同源基因：Sonichedgehog(Shh)，Deserthedgehog(Dhh)和Indianhedgehog(Ihh)，分別編碼Shh，Dhh，Ihh蛋白。其中Shh研究最為廣泛，位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂的3區(qū)6帶(7q36)，編碼一種與早期胚胎發(fā)育密切相關(guān)的Shh分泌蛋白，在人體多種組織細(xì)胞中都有分布。新近的研究表明[5]，Shh蛋白參與了基因的轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞因子以及某些功能蛋白的表達(dá)，器官的正常構(gòu)建，腫瘤的發(fā)生等一系列事件。在Shh信號(hào)通路激活異常后，可引起許多組織器官腫瘤的形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，炎性鼻咽黏膜組織的Shh多為陰性表達(dá)，僅5例呈弱陽(yáng)性，而NPC組織的Shh表達(dá)呈(++～+++)，表達(dá)陽(yáng)性率58.0%，高于炎性組織的19.2%，P<0.05。提示在炎性鼻咽組織中可能也有Shh信號(hào)通路的存在，但此通路處于靜止?fàn)顟B(tài)，而NPC組織中可能存在著此信號(hào)通路的過(guò)度激活。劉森林等[6]在對(duì)68例胃癌組織標(biāo)本研究中也發(fā)現(xiàn)Shh陽(yáng)性表達(dá)45例，陽(yáng)性表達(dá)率為66.8%，Shh的陽(yáng)性表達(dá)與癌組織浸潤(rùn)的深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期等密切相關(guān)。這與其他一些學(xué)者[7-9]的研究相似，認(rèn)為Shh蛋白在干細(xì)胞的分裂、分化、死亡等過(guò)程中起著重要作用，并影響正常黏膜上皮細(xì)胞的分化，使其停止在不同的腫瘤分期。本研究也顯示NPC中Shh表達(dá)在T3～T4期高于T1～T2期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(均P<0.05)，提示Shh為NPC上調(diào)的表達(dá)蛋白，在NPC的發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞分泌Shh蛋白越多，其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，其表達(dá)升高可能通過(guò)激活某種機(jī)制而參與了NPC的發(fā)生。另外本研究中Shh蛋白表達(dá)位于癌巢腫瘤細(xì)胞著色尤為明顯，這也提示具有轉(zhuǎn)移潛能的癌細(xì)胞多位于癌巢的周邊，有利于腫瘤細(xì)胞脫離原灶向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

增殖細(xì)胞核抗原PCNA蛋白是一種相對(duì)分子質(zhì)量為36KD的酸性蛋白質(zhì)，是DNA聚合酶的輔助蛋白，對(duì)調(diào)節(jié)DNA的合成和增殖有重要的作用，僅出現(xiàn)在增殖狀態(tài)細(xì)胞核內(nèi)，其表達(dá)在G1期開(kāi)始增強(qiáng)，逐漸增加到S期達(dá)到高峰，G2、M期明顯下降，在G0無(wú)明顯表達(dá)[10]。PCNA表達(dá)量的變化與DNA合成一致，可作為細(xì)胞增殖狀態(tài)的一項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)[11]。PCNA在腫瘤組織高表達(dá)者表明癌組織處于高度增殖狀態(tài)，腫瘤生長(zhǎng)速度快，局部浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性大，提示PCNA與腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCNA在NPC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為76.0%，在伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)93.3%，提示PCNA的表達(dá)升高有可能參與了NPC細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。但本實(shí)驗(yàn)中PCNA表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤侵襲范圍及分期無(wú)關(guān)，這可能與選擇的標(biāo)本例數(shù)偏少，以及檢測(cè)方法不同有關(guān)。推測(cè)PCNA是反映NPC增殖活動(dòng)的重要指標(biāo)之一，檢測(cè)PCNA的表達(dá)可以作為預(yù)測(cè)鼻咽癌預(yù)后的有用指標(biāo)，與其他相關(guān)因子聯(lián)合檢測(cè)可能更有利于評(píng)估鼻咽癌的預(yù)后。

胡偉國(guó)等[15]研究認(rèn)為Shh信號(hào)途徑與干細(xì)胞的自我更新和增殖密切相關(guān)一致。孫炯等[12]研究中發(fā)現(xiàn)，Shh通過(guò)控制細(xì)胞周期蛋白D和p21來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖，通過(guò)作用于3-磷酸肌醇激酶、Bc1-2而抑制上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的高增殖活性。本研究發(fā)現(xiàn)，Shh表達(dá)與PCNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.426，P<0.05)，提示Shh蛋白表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)。結(jié)合相關(guān)研究，初步推測(cè)，在組織細(xì)胞的損傷修復(fù)過(guò)程中，Shh信號(hào)通路呈一過(guò)性激活，促進(jìn)上皮細(xì)胞中的干細(xì)胞自我更新，但長(zhǎng)期慢性刺激使Shh信號(hào)持續(xù)活化，使腫瘤細(xì)胞的PCNA陽(yáng)性表達(dá)率顯著增高，誘導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞的無(wú)序增殖而誘發(fā)惡變。

綜上所述，檢測(cè)NPC組織中的Shh及PCNA表達(dá)有利于判斷NPC原發(fā)病灶浸潤(rùn)生長(zhǎng)程度和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，能為評(píng)估NPC的預(yù)后提供參考。

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Expression of Shh protein and PCNA protein in hedgehog signal transduction pathway in nasopharyngeal carcinoma

YAOLi,NIEGuohui,CAIZhi,LUXing,LIUFeng’an.

(DepartmentofOtolaryngology,PekingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036，China)

Correspondenceauthor:LUXing,Email:Luxing006@126.com

Objective To study the expression of Shh protein and proliferating cell nuclearantigen(PCNA) in nasopharyngeal carcinoma. Methods Immunohistochemical Elivision PIus two-step method, to detect the expression of Shh and PCNA protein in 50 cases of nasopharyngeal carcinoma and 26 cases of inflammatory nasopharyngeal mucosa during March 2009 to January 2014,at the Peking University Shenzhen hospital. Results Shh and PCNA in nasopharyngeal carcinoma (NPC) were compared with nasopharyngeal tissue of chronic inflammation showed higher expression(P<0.05).In the NPC tissues between Shh expression and the degree of cervical lymph node metastasis is significantly correlated (P<0.05)；Shh protein expression and NPC clinical staging has close relationship(P<0.05). The expression of PCNA in NPC and cervical lymph node metastasis is correlated ,but not correlated with the clinical stage. Shh high expression of the case group PCNA positive rate is also high； and Shh low expression of the case group PCNA positive rate is low, the two expression is positively correlated. Conclusions Theexpression of Shh protein was related to the high proliferative activity of the tumour, Shh and PCNA detection in nasopharyngeal carcinoma (NPC), help to judge nasopharyngeal carcinoma primary lesion growth degree of infiltration, and the transfer of risk, provide a reference for judging the prognosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC).

Nasopharyngeal carcinoma； Shh； PCNA； Prognosis； Tumor marker

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201302072)

518036 廣東 深圳， 北京大學(xué)深圳醫(yī)院 耳鼻咽喉科

陸興，Email：Luxing006@126.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.01.005

1674-4136(2017)01-0017-04

2016-05-01][本文編輯：李慶]