許菊青， 楊舒， 毛啟星， 樊衛(wèi)飛， 蔣峰

論 著

CYP3A4、CYP3A5在肺腺癌中表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性

許菊青， 楊舒， 毛啟星， 樊衛(wèi)飛， 蔣峰

目的 探討CYP3A4、CYP3A5在肺腺癌組織中的表達(dá)水平及與預(yù)后的相關(guān)性。方法 收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科87例肺腺癌病理組織及其對(duì)應(yīng)的臨床資料，病理標(biāo)本制作組織芯片，通過免疫組化法明確組織芯片中CYP3A4、CYP3A5蛋白的表達(dá)情況，結(jié)合臨床病理特征和隨訪資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 肺腺癌組織芯片的免疫組化結(jié)果顯示，CYP3A4在肺腺癌組織中顯著高表達(dá)，而其在癌旁正常組織中則顯著低表達(dá)(P=0.012)；肺腺癌中CYP3A4的表達(dá)水平與肺腺癌TMN分期(P=0.013)和腫瘤分化程度(P=0.044)相關(guān)。與之相反，CYP3A5在肺腺癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織(P<0.001)；肺腺癌中CYP3A5的表達(dá)與肺腺癌組織分化程度(P=0.013)顯著相關(guān)。CYP3A4高表達(dá)患者總生存期和無瘤生存期較CYP3A4低表達(dá)患者顯著縮短(P<0.05)，CYP3A5低表達(dá)患者總體生存期和無瘤生存期較CYP3A5高表達(dá)患者顯著縮短(P<0.05)；聯(lián)合分析顯示，CYP3A4高表達(dá)合并CYP3A5低表達(dá)的患者預(yù)后較其他患者差(P<0.05)，COX多因素分析顯示，CYP3A4高表達(dá)合并CYP3A5低表達(dá)為肺腺癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論 CYP3A4高表達(dá)合并CYP3A5低表達(dá)是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；CYP3A4高表達(dá)合并CYP3A5低表達(dá)可作為預(yù)測(cè)肺腺癌預(yù)后的一個(gè)新靶標(biāo)。

CYP3A4； CYP3A5； 肺腺癌； 預(yù)后； 免疫組化

CYP3A4和CYP3A5是細(xì)胞色素P450酶系(cytochrome P450 enzyme system，CYPs)3A亞家族的主要成員。其傳統(tǒng)的生物學(xué)功能是參與內(nèi)外源性物質(zhì)代謝。目前的研究熱點(diǎn)主要集中在CYP3A4、CYP3A5多態(tài)性和腫瘤易感性，以及化療藥物代謝和腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系方面。我們采用免疫組化法檢測(cè)肺腺癌組織芯片CYP3A4和CYP3A5的表達(dá)，分析并探討CYP3A4和CYP3A5與肺腺癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 87例肺腺癌組織切片標(biāo)本及相應(yīng)癌旁組織切片標(biāo)本都來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，臨床數(shù)據(jù)(包括患者性別、年齡、吸煙情況以及腫瘤分期、大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)來源于該院病案室的病案記錄。按照TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期34例，Ⅱ期24例，Ⅲ期29例。其中男性21例，女性66例。年齡30～78歲，平均年齡65.21歲。87例均具有隨訪記錄，隨訪率100%?；颊邿o瘤生存期(Disease-free survival, DFS)是從手術(shù)當(dāng)天至疾病復(fù)發(fā)的時(shí)間，總生存期(Overall survival，OS)即手術(shù)當(dāng)天至隨訪日(通過身份證信息或電話隨訪)。

1.2 組織芯片制作及免疫組化染色 87例肺腺癌組織標(biāo)本均為10%甲醛固定，石蠟包埋，蠟塊經(jīng)篩選無明顯缺陷。制作成組織芯片。免疫組織化學(xué)染色按En Vision二步法進(jìn)行，具體步驟按說明書進(jìn)行。CYP3A4單克隆抗體經(jīng)Tris-EDTA緩沖液(pH=9.0) 沸水浴抗原修復(fù)，DAB顯色，以試劑盒提供的陽性切片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照，在顯微鏡下結(jié)合常規(guī)HE染色片觀察切片的顯色反應(yīng)。重復(fù)以上操作檢測(cè)CYP3A5。

1.3 結(jié)果判定 分別觀察CYP3A4、CYP3A5蛋白的分布、陽性強(qiáng)度和陽性率。免疫組化結(jié)果判斷采用雙盲法，由兩位病理科醫(yī)師對(duì)組織芯片上每個(gè)位點(diǎn)的染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。在高倍鏡下(×400)分別對(duì)每個(gè)位點(diǎn)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，每例共計(jì)400個(gè)，按要求分別記錄染色陽性細(xì)胞百分比及強(qiáng)度。若遇到各代表位點(diǎn)染色差異較大的情況，則另作該例標(biāo)本的常規(guī)切片觀察。免疫組化染色陽性信號(hào)為棕黃色或褐色，在高倍鏡下觀察，根據(jù)染色陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)目所占百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)占0%為0分；1%～33%為1分；34%～66%為2分；67%～100%為3分。染色強(qiáng)度按腫瘤細(xì)胞著色的深淺計(jì)分：無著色為0分，黃色為弱陽性計(jì)1分，淺棕色為中等陽性計(jì)2分，棕褐色為強(qiáng)陽性計(jì)3分；根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分之和進(jìn)行判斷：0～2分為低表達(dá)，3～6分為高表達(dá)。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析。計(jì)量資料采用四格表χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法，生存分析用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)以及COX回歸分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP3A4、CYP3A5在肺腺癌中的表達(dá) 87例肺腺癌組織切片標(biāo)本行免疫組化染色后顯示，CYP3A4、CYP3A5主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)可同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞核。CYP3A4在肺腺癌組織中顯著高表達(dá)，其表達(dá)陽性率為73.6%(64/87)，而在癌旁正常組織中則顯著低表達(dá)(P=0.012)；CYP3A5在肺腺癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織(P<0.001)，CYP3A5在肺腺癌組織中呈弱陽性表達(dá)，其表達(dá)陽性率為49.4%(43/87)(圖1～2)。

2.2 CYP3A4、CYP3A5的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系 CYP3A4在肺腺癌中的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜侵犯無關(guān)，而與TMN分期(P=0.013)和分化程度(P=0.044)相關(guān)。CYP3A5在肺腺癌中的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TMN分期和胸膜侵犯無關(guān)，而與分化程度(P=0.013)顯著相關(guān)(表1)。

圖1 肺腺癌組織及癌旁正常組織CYP3A4表達(dá)(×400)

圖2 肺腺癌組織及癌旁正常組織CYP3A5表達(dá)(×400)

表1 CYP3A4、CYP3A5表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系

*：不同表達(dá)水平比較，P<0.05

2.3 預(yù)后分析Kaplan-Meier生存分析顯示，CYP3A4高表達(dá)患者總體生存期(P=0.002)和無瘤生存期(P=0.002)較CYP3A4低表達(dá)患者顯著縮短， CYP3A5低表達(dá)患者總體生存期(P=0.006)和無瘤生存期(P=0.007)較CYP3A5高表達(dá)患者顯著縮短。聯(lián)合分析顯示，CYP3A4低表達(dá)合并CYP3A5高表達(dá)與CYP3A4低表達(dá)合并CYP3A5低表達(dá)患者預(yù)后較好，這兩組患者間的生存期沒有明顯差異；CYP3A4高表達(dá)合并CYP3A5低表達(dá)與CYP3A4高表達(dá)合并CYP3A5高表達(dá)總體生存期和無瘤生存期明顯縮短，其中CYP3A4高表達(dá)合并CYP3A5低表達(dá)的患者總生存期(P=0.036)和無瘤生存期(P=0.036)最短，預(yù)后最差。再進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CYP3A4高表達(dá)合并CYP3A5低表達(dá)是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

CYP3A4和CYP3A5是細(xì)胞色素酶P450 CYP3A亞家族的2個(gè)主要成員，其含量豐富，底物覆蓋廣泛，兩者催化50%以上臨床常用藥物的氧化還原反應(yīng)[1]，包括抗雌激素藥物他莫昔芬，抗癌藥物環(huán)磷酰胺、多西他賽、長春堿類，以及靶向藥物索拉菲尼、舒尼替尼等，是藥物代謝反應(yīng)中最主要的限速酶。CYP3A還參與了多種前致癌物質(zhì)和致突變物的活化代謝過程，并與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

CYP3A4主要分布在肝臟和小腸，是成人肝臟表達(dá)的主要CYP蛋白，CYP3A5主要分布于一些肝外組織如腸壁、腎、前列腺和肺等。CYP3A4和CYP3A5的表達(dá)及活性有著很大的個(gè)體間、種族間差異，這主要由CYP3A單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)決定。

CYP3A4/CYP3A5在肺癌中的作用尚不明確，研究結(jié)果也不盡相同。一組涵蓋了801例患者的病例對(duì)照研究顯示攜帶CYP3A4*1B基因型可明顯增加小細(xì)胞肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)CYP3A5*3純合子基因型使肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加了4.3倍，并且CYP3A4*1B和CYP3A5*3多態(tài)性決定了在化療藥物療效及毒性方面存在個(gè)體差異性，兩者在指導(dǎo)肺癌個(gè)體化治療及藥物代謝方面起重要作用[3]。但是，通過檢索pubmed數(shù)據(jù)庫，截至2016年9月，未見有CYP3A4、CYP3A5對(duì)肺癌惡性生物學(xué)行為及預(yù)后的影響方面的報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，CYP3A4在肺腺癌中顯著高表達(dá)，且腫瘤分期越晚、分化程度越低其表達(dá)越高。CYP3A4低表達(dá)組患者總體生存期和無瘤生存期較CYP3A4高表達(dá)組患者明顯延長，提示CYP3A4高表達(dá)可能在促進(jìn)肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用，從而導(dǎo)致較差的預(yù)后。Mitra等[4]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CYP3A4促進(jìn)激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞惡性增殖的信號(hào)通路，CYP3A4促進(jìn)(±)-14，15-EET(環(huán)氧二十碳三烯酸)生物合成，抑制了激活因子3(STAT-3)磷酸化作用和核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致惡性細(xì)胞的無限增殖。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的“癌基因”生物學(xué)功能，機(jī)制可能是CYP3A4可通過造成肝癌細(xì)胞低氧環(huán)境來誘導(dǎo)低氧反應(yīng)元件(HRE)啟動(dòng)子活性的增強(qiáng)，促進(jìn)促紅細(xì)胞生成素(EPO)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA表達(dá)含量的增加，繼而誘導(dǎo)磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路的活化，PI3K/Akt參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖遷移[5]。

本研究結(jié)果還顯示CYP3A5在癌旁正常肺組織的表達(dá)明顯高于腫瘤組織，這與Anttila等[6]的研究結(jié)果一致。癌組織中CYP3A5高表達(dá)組患者總體生存期和無瘤生存期較低表達(dá)組患者明顯延長，提示CYP3A5可能在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程涉及細(xì)胞-細(xì)胞間及細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用中發(fā)揮抑癌作用。研究表明，CYP3A5活性酶能催化6β-羥基睪酮，誘導(dǎo)睪酮失活，從而抑制激素依賴性的前列腺細(xì)胞的惡性增殖[7]。Jiang Feng團(tuán)隊(duì)[8]發(fā)現(xiàn)CYP3A5可作為一個(gè)保護(hù)性因子抑制肝細(xì)胞肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移，其抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是CYP3A5通過細(xì)胞內(nèi)ROS單純抑制mTORC2激酶活性，進(jìn)而選擇性抑制AKT(S473)活化，引起AKT信號(hào)通路下調(diào)，從而抑制肝細(xì)胞肝癌侵襲轉(zhuǎn)移。

進(jìn)一步分析，我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CYP3A4合并低表達(dá)CYP3A5的肺腺癌患者預(yù)后最差，是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素。因此認(rèn)為，高表達(dá)CYP3A4和低表達(dá)CYP3A5可能可以作為預(yù)測(cè)肺癌預(yù)后的新靶標(biāo)，為肺癌的個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

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Relationship between the expressions of CYP3A4, CYP3A5 and prognosis in lung adenocarcinoma

XUJuqing1,2,YANGShu2,MAOQixing1，F(xiàn)ANWeifei2,JIANGFeng3.

(1.TheFourthSchoolofClinicalMedicine,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China; 2.DepartmentofOncology,JiangsuProvinceGeriatricHospital,Nanjing210024,China; 3.DepartmentofThoracicSurgery,NanjingMedicalUniversityaffiliatedCancerHospital,Nanjing210009,China)

Correspondingauthor：JIANGFeng,Email：jiangfeng174@sohu.com

Objective To investigate the expression of CYP3A4 and CYP3A5 in lung adenocarcinoma and its correlation with prognosis. Methods The clinical features of 87 lung adenocarcinoma patients were collected. Subsequently, immunohistochemical (IHC) analysis was performed to detect CYP3A4 and CYP3A5 expressions in 87 lung adenocarcinoma cases on a tissue microarray sample. Finally, the relationship between CYP3A4 and CYP3A5 expression as well as the clinic pathological characteristics of NSCLC were analyzed statistically. Results Our study showed that the expression of CYP3A4 was significantly higher in lung adenocarcinoma than that in normal tumor-adjacent tissues (P=0.012). CYP3A4 protein expression in lung adenocarcinoma was related to TNM stage (P=0.013) and differentiation (P=0.044). Expression of CYP3A5 was lower in lung adenocarcinoma than that in normal-adjacent tissues (P<0.05). Significance was observed between CYP3A5 expression and differentiation (P=0.013). The Kaplan-Meier method suggested that high CYP3A4 and low CYP3A5 expressions were significantly associated with short disease-free survival and overall survival of patients. Conclusions This study provides evidence that the high CYP3A4 and low CYP3A5 expression level was an independent risk factor of lung adenocarcinoma and could act as a new target for prognosis of lung adenocarcinoma.

CYP3A4; CYP3A5; Lung adenocarcinoma; Prognosis; Immunohistochemical

210029 江蘇 南京，南京醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院(許菊青，毛啟星)； 210024 江蘇 南京，江蘇省老年醫(yī)院腫瘤科(許菊青，楊舒，樊衛(wèi)飛)； 210009 江蘇 南京，南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 胸外科(蔣峰)

蔣峰，Email：jiangfeng174@sohu.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.01.006

1674-4136(2017)01-0021-04

2016-10-27][本文編輯：李筱蕾]