李美鳳，祁海燕，封繼宏△，魏葆琳

1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(天津 300150)，2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

扶正解毒法對(duì)肺炎模型大鼠的p38MAPK信號(hào)通路調(diào)控及抗氧化應(yīng)激作用*

李美鳳1，祁海燕2，封繼宏1△，魏葆琳1

1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(天津 300150)，2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

目的：觀察扶正解毒中藥對(duì)肺炎模型大鼠p38MAPK信號(hào)通路的調(diào)控及抗氧化應(yīng)激作用。方法：將60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組、模型組、扶正中藥組、解毒中藥組、扶正解毒中藥組和抗生素干預(yù)組，除空白組外均采用氣管內(nèi)滴注肺炎鏈球菌建立肺炎大鼠模型，然后空白組及模型組給予生理鹽水灌服，各干預(yù)組對(duì)應(yīng)給予藥物治療，共7 d，分別于第4天、第8天取材，采用生化法檢測大鼠血清SOD、MDA、MPO、LPO含量，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA )檢測大鼠血清TNF-α含量，采用免疫印跡法檢測肺組織p38MAPK表達(dá)情況。結(jié)果：模型組大鼠血清中MDA、MPO、LPO、TNF-α均較空白組升高(P<0.05)，各藥物干預(yù)組與模型組相比，上述四種細(xì)胞因子水平均下降(P<0.05)；模型大鼠血清中SOD較空白組下降(P<0.05)，各藥物干預(yù)組與模型組相比，表達(dá)含量均有所升高(P<0.05)；模型組大鼠肺組織P38MAPK表達(dá)較空白組升高(P<0.05)，各藥物干預(yù)組與模型組相比較，P38MAPK表達(dá)水平均下降(P<0.05)。結(jié)論：扶正解毒中藥可以通過調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路下調(diào)炎癥因子的表達(dá)及促進(jìn)抗氧化應(yīng)激，以減輕自由基等過氧化物對(duì)機(jī)體的損傷，減輕肺部氣道炎癥應(yīng)答反應(yīng)，從而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。

社區(qū)獲得性肺炎(Community acquired pneumonia，CAP)是由細(xì)菌、病毒、非典型病原體等引起的、發(fā)生在肺實(shí)質(zhì)的炎癥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)肺炎進(jìn)展過程中存在以“肺脾氣虛”為主的正虛及“痰、熱、瘀”為主的邪實(shí)，認(rèn)為其治療應(yīng)扶正祛邪，制定了扶正解毒、清熱化瘀治則，研制出扶正解毒方。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合扶正解毒中藥可以明顯改善患者臨床癥狀，縮短患者退熱時(shí)間及住院天數(shù)[1]。本文旨在探討扶正解毒方對(duì)肺炎鏈球菌所致肺炎模型大鼠p38MAPK信號(hào)通路的調(diào)控與抗氧化應(yīng)激的作用。

材料與方法

1 動(dòng) 物 選用清潔級(jí)雄性Wistar大白鼠60只，平均體重180g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)1周進(jìn)行造模。

2 造模用細(xì)菌 大鼠造模選用肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(菌株號(hào)：ATC49619)，實(shí)驗(yàn)開始前制備成 1.2×109cfu/ml 菌懸液(注：標(biāo)準(zhǔn)菌株來自于天津市臨檢中心)。

3 藥 品

3.1 西藥：頭孢呋辛酯片,規(guī)格: 250mg/片(生產(chǎn)批號(hào) H20080328);生產(chǎn)廠家：葛蘭素史克(Glaxo Operations UK Limited)。

3.2 中藥處方：扶正解毒中藥,黨參、黃芩、魚腥草、赤芍、紫菀、冬瓜子、甘草；扶正中藥：黨參、甘草；解毒中藥：黃芩、魚腥草、赤芍、紫菀、冬瓜子。

實(shí)驗(yàn)所用藥物均于天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科購買，為保證藥物轉(zhuǎn)換量精確，將所用中藥制備為提取物，最終折合比例為1 g提取物相當(dāng)于生藥3.19 g，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4 試劑盒 超氧化物歧化酶SOD試劑盒、丙二醛MDA試劑盒、髓過氧化物酶MPO試劑盒、脂質(zhì)過氧化物酶LPO試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。

大鼠腫瘤壞死因子TNF-αELISA試劑盒、大鼠抗人磷酸化-p38MAPK抗體由購于華美公司。

5 動(dòng)物模型構(gòu)建 采用課題組自創(chuàng)的內(nèi)窺鏡引導(dǎo)下氣管內(nèi)滴注肺炎鏈球菌菌懸液的方式構(gòu)建肺炎動(dòng)物模型[2]。

6 分組及給藥

6.1 分組：將大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白組、模型組、扶正中藥組、解毒中藥組、扶正解毒中藥組、抗生素干預(yù)組。

6.2 給藥：各實(shí)驗(yàn)組大鼠在造模結(jié)束后第 2 天開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)給藥；空白對(duì)照組：生理鹽水灌胃；模型組：生理鹽水灌胃；扶正中藥組：灌服扶正中藥提取物水溶液，每鼠 0.63 g/(kg·d)；解毒中藥組：灌服解毒中藥提取物水溶液，每鼠 4.58 g/(kg·d)；扶正解毒中藥組：灌服扶正解毒中藥物水溶液，每鼠 5.2 g/(kg·d)；抗生素組：灌服頭孢呋辛酯水溶液，每鼠50 mg/(kg·d)；1次/ d，給藥時(shí)間持續(xù)7 d，每組動(dòng)物分別于治療后第 4天和第8天取材。

7 觀察指標(biāo)

7.1 血清SOD、MDA、MPO、LPO、TNF-α測定，打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血2 ml，3 000r/m離心10 min，分離血清，-80℃分裝保存。SOD、MDA、MPO、LPO采用生化法， TNF-α采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，操作均根據(jù)試劑盒進(jìn)行。

7.2 開胸取肺組織，用于p38MAPK檢測，采用免疫印跡法(West blot)檢測。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或四分衛(wèi)間距形式表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較行ANOVA，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，模型組死亡2只，解毒中藥組死亡1只，其余各組大鼠例數(shù)未發(fā)生變化。

1 大鼠血清SOD、MDA、MPO、LPO表達(dá) 模型組大鼠血清中MDA、MPO、LPO均較空白組升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；各藥物干預(yù)組與模型組相比，三細(xì)胞因子水平均下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。模型大鼠血清中SOD較空白組下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；各藥物干預(yù)組與模型組相比，表達(dá)均升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清SOD、MDA、MPO、LPO結(jié)果

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

2 大鼠血清腫瘤壞死因子TNF-α表達(dá) 模型組大鼠血清中TNF-α較空白組升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；各藥物干預(yù)組與模型組相比，三細(xì)胞因子水平均下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表2。

3 大鼠肺組織p38MAPK蛋白表達(dá) 模型組大鼠肺組織P38MAPK表達(dá)較空白組升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；各藥物干預(yù)組與模型組相比，P38MAPK表達(dá)水平均下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表3。

表2 各組大鼠血清TNF-α結(jié)果比較(ng/L)

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

表3 各組大鼠肺組織P38MAPK表達(dá)比較

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與扶正解毒中藥組相比，&P<0.05

肺炎模型大鼠血清、肺組織中存在炎癥因子表達(dá)異常及氧化應(yīng)激，扶正解毒中藥可以降低炎癥因子的表達(dá)、減輕氧化應(yīng)激，進(jìn)而減輕機(jī)體損傷。

討 論

現(xiàn)代研究[5]證實(shí)MAPK通路能被多種生物活性物質(zhì)(如各種氧化應(yīng)激中間產(chǎn)物、炎癥因子等)激活，調(diào)控著炎癥的發(fā)生和發(fā)展；p38MAPK是MAPK家族重要組成成員，扮演著轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐的角色，參與了多種細(xì)胞信號(hào)(如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等)的傳導(dǎo)，其蛋白磷酸化水平增強(qiáng)是MAPK通路激活的標(biāo)志，其可以促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，亦可激活一氧化氮合成酶(iNOS)基因轉(zhuǎn)錄、編碼大量蛋白，進(jìn)而產(chǎn)生大量NO，誘發(fā)炎癥瀑布。徐蕾等人[3]發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌Spsp A誘導(dǎo)人類單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子受ERK和p38MARK 途徑調(diào)控。吳盈盈等[4]發(fā)現(xiàn)HSP40誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答受JNK及p38MAPK信號(hào)通路調(diào)控。

氧化應(yīng)激是指在內(nèi)外環(huán)境有害刺激的條件下，機(jī)體產(chǎn)生大量高活性分子，例如活性氮自由基、活性氧自由基，超出機(jī)體對(duì)其清除的能力，氧化-抗氧化失衡，導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclear leukocytes，PMN)浸潤，促使過多氧化中間產(chǎn)物生成，推動(dòng)了氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展，對(duì)機(jī)體造成損害[6]?；钚匝醮豏OS、丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD是評(píng)價(jià)氧化-抗氧化系統(tǒng)的重要指標(biāo)，作為脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物的丙二醛為評(píng)估機(jī)體氧化損傷程度提供了重要依據(jù)，SOD幫助清除氧自由基，用來評(píng)價(jià)機(jī)體的抗氧化能力。楊小瓊[7]等人通過研究發(fā)現(xiàn)肺炎的過程中存在氧化應(yīng)激，并且參與了細(xì)胞DNA 損傷，對(duì)肺炎的發(fā)生發(fā)展起了一定的作用。另有研究[8]顯示MAPK可以被氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的大量ROS誘導(dǎo)活化。

本課題組根據(jù)中醫(yī)理論和長期臨床實(shí)踐，提出肺炎“因虛致病”的理論，認(rèn)為肺炎初期及疾病進(jìn)展過程中都存在正虛，以肺脾虧虛為主；細(xì)菌、病毒及非典型病原體等毒邪乘虛而入侵犯機(jī)體，正邪相爭而發(fā)熱，熱壅血瘀、氣機(jī)阻滯致使病情加重。認(rèn)為肺炎治療需扶正祛邪相結(jié)合，健脾益氣而扶正，清熱解毒以祛邪。因此制定了扶正解毒、清熱化瘀治則，尊“參蘇飲”、“千金葦莖湯”化裁而出扶正解毒方，其主要組成為黨參、黃芩、魚腥草、虎杖、赤芍、白及、冬瓜子、紫菀和甘草。方中黨參健脾益肺，黃芩、魚腥草清熱解毒，虎杖、赤芍清熱散瘀，白及、冬瓜子逐瘀排膿兼通腑泄熱，紫菀化痰止咳，甘草調(diào)和諸藥，健脾補(bǔ)肺扶助正氣，通腑泄熱調(diào)暢氣機(jī)，散瘀解毒祛邪外出。

本研究結(jié)果顯示，肺炎模型大鼠炎癥因子及自由基(TNF-α、MDA、MPO、LPO、p38MAPK)均明顯升高，抗氧化能力(SOD)明顯下降，給予藥物干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)扶正解毒中藥及抗生素兩組效果較明顯。表明扶正解毒中藥可以通過抑制前炎癥因子的釋放和氧化應(yīng)激過度爆發(fā)，進(jìn)而抑制p38MAPK磷酸化，抑制下游炎癥因子的表達(dá)，減少對(duì)機(jī)體的炎癥損傷，以對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。

[1] 封繼宏.基于“真實(shí)世界”的社區(qū)獲得性肺炎中醫(yī)證治初探研究[D].天津：天津中醫(yī)藥大學(xué), 2013.

[2] 封繼宏,祁海燕,鄭兆曄,等. 經(jīng)硬式鼻腔鏡氣管內(nèi)滴注化學(xué)制劑建立AECOPD動(dòng)物模型[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 17(11): 68-70.

[3] 徐 蕾,陳小琴.MAPK 通路對(duì)肺炎鏈球菌表面蛋白A促人類單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響[J].免疫學(xué)雜志,2014,30(2):139 -146．

[4] 吳盈盈,高 松,馬 峰,等.肺炎鏈球菌熱休克蛋白40 通過p38MAPK 和JNK通路誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2015, 31(6): 730-735.

[5] 張 奇,白曉東,付小兵. p38MAPK信號(hào)通路研究進(jìn)展[J]. 感染、炎癥、修復(fù), 2005, 6(2):121-123.

[6] 楊 明,李國平.氧化應(yīng)激激活的信號(hào)傳導(dǎo)與支氣管哮喘的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2014,43(7) : 875.

[7] 楊小瓊,李國平,王孝蕓,等.氧化應(yīng)激 DNA損傷在重癥肺炎中的作用研究[J].國際呼吸雜志, 2016, 36(17):1308-1313.

[8] Sun Z, Huang Z, Zhang DD. Phosphorylation of Nrf2 at multiple sites by MAP kinases has a limited contribution in modulating the Nrf2-dependent antioxidant response[J]. PLoS One, 2009, 4(8): e6588.

(收稿：2017-01-11)

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373849)

肺炎, 肺炎球菌性/中醫(yī)藥療法 扶正解毒法 @TNF-α @p38MAPK

R563.1

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.05.059

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目(15ZXLCSY00020)

△通訊作者