劉帥軍 沈丹 鐘繼漢 陳偉 王偉 張麗 陳才 楊昆侖 高波 宋成義

（揚州大學動物科學與技術學院 揚州大學農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，揚州 225009）

SB轉座子介導的斑馬魚增強子捕獲注解分析

劉帥軍 沈丹 鐘繼漢 陳偉 王偉 張麗 陳才 楊昆侖 高波 宋成義

（揚州大學動物科學與技術學院 揚州大學農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，揚州 225009）

為了建立斑馬魚增強子捕獲突變體庫及研究功能基因的表達調控模式，制備了SB轉座子介導的增強子捕獲轉基因斑馬魚（F0），通過繁育建立了組織或器官特異表達報告基因綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的品系（F1）。選擇F1代的SK-3系（腦部特異表達GFP）與野生型TU系斑馬魚交配，收集受精卵（F2），于24 hpf（Hour post fertilization）、2 dpf（Day post fertilization）、3 dpf、4 dpf、5 dpf、7 dpf 6個發(fā)育階段檢測報告基因綠色熒光蛋白的表達模式；然后通過Splinkerette PCR（SP-PCR）方法檢測SB轉座子在斑馬魚基因組中的插入位置，從而確定捕獲的增強子和功能基因；最后通過胚胎原位雜交驗證內源基因表達模式。結果表明，在F2代胚胎不同發(fā)育階段，GFP表達具有明顯的時空特性，前期在前腦，中腦，后腦三個部位均高水平表達，后期表達部位呈后移趨勢，各個發(fā)育期表達強度基本無變化，結果提示該捕獲增強子具有腦部表達特性。sp-PCR結果分析表明增強子位于基因組1號染色體 35、914、498-35、914、621位置，在內源性基因ednraa位點附近。原位雜交結果表明該基因在胚胎24 hpf階段具有轉錄活性。本研究結果提示SB轉座子介導的增強子捕獲技術可高效獲得插入突變斑馬魚，對研究基因功能和獲得具有自主知識產(chǎn)權的新基因具有重要作用。

增強子捕獲；注解；SB；斑馬魚

增強子在真核生物的基因調控中，是一個重要的順式元件，起到調節(jié)相關基因表達的開關作用［1］，能對靶向基因進行時空表達的調控［2］。增強子的活性則受到多種因素的影響，只有在特定條件下才能增加靶向基因的表達，因此增強子的活性是處在不斷變化之中［2］。增強子的獲得對研究基因表達調控特性具有重要意義，但用傳統(tǒng)的方法去獲得和注解增強子是相當困難的。增強子捕獲（Enhancer trapping，ET）是用來確定一段DNA序列中是否包含增強子功能的一項技術，是一種研究增強子控制細胞中基因時空表達模式特征的有效方法［3］。增強子捕獲載體通常由迷你啟動子驅動報告基因隨機整合到基因組中用以提供一種直接簡單的手段來測定控制基因表達的調節(jié)模塊［4］。最早在1992年，Korn等［5］已嘗試在小鼠上建立增強子檢測方法，隨后Grabher等［6］在青鳉（Medaka）中成功應用了以轉座子為介導的增強子捕獲技術，在斑馬魚上也有SB轉座子［7］，TOL2轉座子［8］介導的增強子捕獲的報道。

斑馬魚屬脊椎動物亞門，輻鰭魚綱（Actinopterygii），鯉科，短擔尼魚屬（Danio）的一種硬骨魚，因其全身分布有深藍色與銀白色相間的縱紋，酷似非洲草原斑馬而得名斑馬魚。至20世紀80年代斑馬魚被引入實驗室，現(xiàn)如今已成為研究脊椎動物發(fā)育學和胚胎學的模式生物［9，10］。斑馬魚基因序列與人類基因的高度同源性，達到了87%的相似性，近年來被用于作為研究人類各種疾病的模型，廣泛的應用于生命科學領域［11］。斑馬魚的受精卵容易大量獲得、發(fā)育快、胚胎透明，在受精24 h后已經(jīng)有器官的發(fā)生，發(fā)育至5 d時主要的器官已經(jīng)形成并發(fā)揮相應的作用，這些特點便于對斑馬魚進行遺傳學操作及實時監(jiān)測發(fā)育過程。本實驗以斑馬魚為模式生物，初步探討SB轉座子介導的增強子捕獲技術的有效性，從而為高通量捕獲增強子和基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Tuebingen斑馬魚（Danio rerio）購自國家斑馬魚資源中心；SB轉座子介導的增強子捕獲轉基因斑馬魚F1 代SK-3系為本實驗室制備。

基因組提取試劑盒購自寶生物工程有限公司，限制性內切酶Sau3A1，T4 DNA Ligase，Annealing Buffer均購自NEB有限公司，無RNA酶DNAse1，RNAsein，NaOH，鏈酶蛋白酶，多聚甲醛，PTU，HEPES，Tween20，tRNA，肝素鈉，苯酚，氯仿，HCl，BCIP，NBT等購自Sigma公司；地高辛標記RNA混合液，蛋白酶K，羊抗地高辛標記物抗體等購自Roche公司；轉錄緩沖液，T7 RNA聚合酶等購自Promega公司；去離子甲酰胺購自CarloErba；羊血清，無水甲醇，NaCl，KCl，MgCl2，無水乙醇等購自國藥。

1.2 方法

1.2.1 F2代魚胚收集和熒光檢測 將SK-3系與TU系野生型斑馬魚進行交配，獲得F2代胚胎，培養(yǎng)于E3溶液中至特定的發(fā)育時期以備熒光檢測。在體式熒光顯微鏡（M165FC，Lecia，德國）下觀察不同時期的胚胎GFP的表達并做好記錄。本實驗中觀察的胚胎GFP的表達時期分別是24 hpf、2 d、3 d、4 d、5 d、7 d。在檢測完熒光之后，收集5-10尾F2代斑馬魚繼續(xù)飼養(yǎng)至20 d后提取基因組備用。

1.2.2 Splinkerette PCR

1.2.2.1 PCR引物序列 根據(jù)轉座元件序列設計兩輪PCR引物，接頭序列參考文獻［12］，引物序列見表1。

表1 Splinkerette PCR兩輪PCR引物序列

1.2.2.2 基因組提取 本實驗采用TaKaRa的基因組提取試劑盒提取飼養(yǎng)20 d的F2代斑馬魚的基因組，將獲得的DNA經(jīng)Nanodrop核酸測定儀（Nanodrop1000，美國）測 得 濃 度 為380 ng/μL，OD260/OD280=1.85，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 基因組打斷 50 μL反應體系為：Genomic DNA 5 μL，10×NEB BUFFER 5 μL，Sau3A1 3 μL，ddH2O補齊至50 μL。將反應體系置于37℃過夜處理，之后用TaKaRa的DNA片段純化試劑盒進行純化并用45 μL ddH2O洗脫。

1.2.2.4 接頭合成 合成體系為50 μL：SPLNK-BOT 2 μL，SPLNKGATC-TOP 2 μL，Annealing Buffer 46 μL。反應程序：95℃，3 mins；自然降至室溫，約30 mins，-20℃保存。

1.2.2.5 接頭連接（Ligated genomic DNA） 50 μL體系包括：Digested genomic DNA 37 μL，10X T4Ligase Buffer 5 μL，annealed splinkerette oligonucleotide 6 μL，T4 DNA Ligase（400 U/μl）1.5 μL，連接反應條件：16℃，16 h。

1.2.2.6 PCR擴增 第一輪PCR（Round 1 PCR）體系50 μL為Ligated genomic DNA 10 μL，ddH2O 11 μL，2× Taqmix 25 μL，F(xiàn)12 2 μL，SB1N 2 μL，PCR擴增程序：95℃預變性 4 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循 環(huán)；最后72℃延伸10 min。第2輪PCR（Round 2 PCR） 體 系50 μL為Round 1 PCR product 1 μL，ddH2O 20 μL，2x Taqmix 25 μL，F(xiàn)14 2 μL，SB2N 2 μL，PCR擴增程序：95℃預變性4 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，35個循 環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應完成后，將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳并切膠回收，測序。

1.2.3 增強子注解 將測序獲得的染色體側翼DNA序列通過BLASTN與ENSEMBL的斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫（GRCz10）進行比對。從Ensembel瀏覽器上下載斑馬魚（Zebrafish）、青鳉（Medaka）、東方紅鰭鲀（Fugu）的側翼序列上下游各50KB區(qū)域的基因組序列（www.ensembl.org），并將所得到的序列進行比對分析（http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit. shtml）。

1.2.4 原位雜交 根據(jù)插入位點處的內源基因Ednraa編碼序列設計RNA原位雜交探針。采用地高辛和T7RNA聚合酶標記合成反義RNA探針。參考文獻［13］進行斑馬魚胚胎原位雜交，通過熒光體式顯微鏡（M165FC，Lecia，德國）采集圖片。

2 結果

2.1 F2代胚胎不同發(fā)育時期GFP表達

將 SK-3系F1與TU系斑馬魚進行雜交，收集胚胎于E3培養(yǎng)液中培養(yǎng)至特定的發(fā)育時期進行觀察，結果（圖1）表明從24 hpf開始，在熒光顯微鏡下可觀察到斑馬魚胚胎腦部有明顯的熒光表達，熒光位置分別是前腦、中腦和后腦。在 2 dpf、3 dpf、4 dpf、5 dpf、7 dpf等發(fā)育時期熒光仍集中于腦部，表達強度基本無變化，而表達部位有所改變（圖2），體現(xiàn)出基因表達調控的時空特性。

圖1 SK-3斑馬魚胚胎24 hpf的腦部熒光表達情況

2.2 增強子捕獲轉基因斑馬魚的增強子注解分析

將測序結果中得到的染色體側翼DNA序列在ENSEMBL的斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫（GRCz10）中進行比對，表明捕獲載體插入1號染色體，捕獲的增強子位于內源基因ednraa 上游20 kb 處。再從Ensembel瀏覽器上下載注解所需的序列文件，經(jīng)分析獲得增強子注解圖（圖3）。

2.3 原位雜交

針對注解得到的結果，根據(jù)Ednraa基因編碼序列設計其反義RNA探針，進行原位雜交驗證，結果見圖4。陰性對照組胚胎的熒光集中于頭部，而Ednraa 反義RNA探針的原位雜交結果顯示胚胎整體明顯著色，且頭部著色較深。

3 討論

近年來，利用轉座子介導法進行斑馬魚基因捕獲、增強子捕獲，獲得突變體，進而研究基因功能及表達調控已獲得較大進展。研究表明來自Tc1/源性基因kctd15a與轉基因斑馬魚熒光蛋白表達模式密切相近，在隨后的發(fā)育階段在神經(jīng)組織中也有相似的時空表達特征。Asakawa等［22］和Takeuchi等［23］Mariner 超家族的SB轉座子［14］，可在不同物種中具有轉座活性，已廣泛應用于魚類、兩棲類、哺乳動物等的轉基因研究［15-19］。由于轉座子在宿主基因組的高效插入，在斑馬魚上利用轉座子介導增強子捕獲技術鑒定了大量增強子［20］。Parinov 等［8］利用TOL2轉座子介導斑馬魚增強子捕獲，建立突變品系，研究斑馬魚發(fā)育的相關功能基因。Balciunas等［7］利用SB轉座子，在斑馬魚中進行增強子捕獲研究，建立了9個突變品系。本課題組采用SB介導的增強子捕獲技術獲得了大量斑馬魚插入突變體，通過報告基因GFP可確定捕獲的增強子和內源基因時空表達特性，大大提高了篩選效率。我們已通過表型篩選建立了若干個突變品系，本研究所用品系表型為頭部區(qū)域發(fā)綠色熒光，對該品系進行注解，獲得了腦部發(fā)育調控增強子，并在其下游定位了一個內源基因。利用轉座子介導在斑馬魚上進行增強子捕獲研究是目前最有效的增強子捕獲技術，篩選突變表型斑馬魚系，為研究相關基因的調控模式提供了很好的工具。Naouel等［21］通過增強子捕獲技術捕獲轉基因斑馬魚品系（ub49），發(fā)現(xiàn)載體插入位點附近內先后分別利用Tol2轉座子介導 Gal4-UAS 系統(tǒng)在斑馬魚上進行腦部神經(jīng)組織電路分析和增強子捕獲研究。本研究建立的斑馬魚品系SK-3，其插入位點附件存在內源基因Ednraa，對該基因進行RNA原位雜交，結果表明該基因具有明顯的轉錄活性，且在頭部表達水平較高，提示該基因在腦部的表達可能被位于其上游的增強子調控，而該增強子具有腦部表達特異性。因此，本研究捕獲得增強子可能與腦部早期發(fā)育有關，該增強子的表達特性和內源基因的確切功能尚需進一步驗證。

圖2 SK-3增強子捕獲轉基因斑馬魚不同發(fā)育時期的熒光表達情況

圖3 SK-3增強子捕獲轉基因斑馬魚的增強子注解

圖4 sk-3系F2代胚胎24 hpf原位雜交圖

相比用F1代轉基因斑馬魚進行注解，本實驗直接利用增強子捕獲轉基因斑馬魚 F2代對其進行注解，F(xiàn)2代的GFP表達的表型更穩(wěn)定，在采集熒光圖片以及后續(xù)的基因組注解上可以耗費更少的時間和精力，大大提高了研究效率。本研究獲得了腦部特異表達GFP的增強子捕獲系，通過其不同發(fā)育階段的表達模式，可以揭示增強子的調控模式及對早期胚胎組織器官發(fā)育相關的功能基因。本研究與報道的增強子捕獲系不同［7］，從而豐富了增強子研究素材。本研究通過生物信息學方法對SK-3系轉座子插入位點進行了較為詳細的注解，獲得了斑馬魚早期胚胎腦部發(fā)育相關的增強子可能的位置及其調控的內源性基因Ednraa，該基因與人類基因組中EDNRA蛋白有高達73%的同源性，而Gordon等［24］研究發(fā)現(xiàn)EDNRA的突變會導致伴有禿頭癥的頜面脂肪癥，而本研究注釋得到的斑馬魚的內源基因Ednraa，因其高度的同源性使得斑馬魚更好地作為研究人類疾病的模式動物。由于GFP表達模式可直接表明該基因時空表達特性，RNA原位雜交初步結果也說明GFP與Ednraa的表達模式基本一致，進一步說明該基因可能受到所捕獲的增強子元件的調控，提示基因捕獲技術對研究基因功能高度有效。

4 結論

本研究通過SB介導的增強子捕獲技術獲得了腦部穩(wěn)定表達GFP的斑馬魚增強子捕獲品系SK-3；通過生物信息學注解獲得了所捕獲的增強子的染色體位置及其下游調控的內源基因Ednraa；GFP與Ednraa的表達模式具有一致性。SK-3系可為斑馬魚腦部神經(jīng)發(fā)育情況的研究提供良好的動物模型。

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（責任編輯 李楠）

The Annotation of Enhancer-trapping Mediated by the SB Transposon in Zebrafish

LIU Shuai-jun SHEN Dan ZHONG Ji-han CHEN Wei WANG Wei ZHANG Li CHEN Cai YANG Kun-lun GAO Bo SONG Cheng-yi
（Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-product Safety，College of Animal Science & Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009）

In order to establish zebrafish enhancer-trapping mutant library and study the expression and regulation of functional genes，we prepared SB（Sleeping Beauty）transposon-mediated enhancer-trapping zebrafish F0，and built the line F1 with tissue- or organ-specific GFP（Green Fluorescent Protein）expression patterns through breeding. We selected SK-3 line of F1（head-specific expressing GFP）to breed with wild type TU zebrafish，and collected fertilized eggs. The GFP expression patterns of early embryos at 24 hpf（Hour post fertilization），2 dpf（Day post fertilization），3 dpf，4 dpf，5 dpf and 7 dpf were analyzed. SP-PCR（Splinkerette PCR）was used to detect the inserted position of SB transposon in the zebrafish genome to determine the captured enhancer and functional gene. The expression patterns of the functional gene were verified by in situ hybridization. The results showed that the expression of GFP had obvious temporal and spatial characteristics in SK-3 embryos at different developmental stages and highly expressed in the forebrain，midbrain and hindbrain at earlier stages，and was in a trend of backward at later stages. There was no variation in the expression level of each developmental stage，indicating that the captured enhancer was specifically expressed in the brain. SP-PCR results showed that the enhancer was located in the chromosome 1：35，914，498-35，914，and 621 near the ednraa. The results of in situ hybridization showed that the gene had transcription activity at the 24 hpf. Above data suggested that the SB transposon-mediated enhancer-trapping technique can be efficiently used to acquire the inserted mutant zebrafish，which has a great significance on the study of gene function and the acquisition of new genes with independent intellectual property rights.

enhancer-trapping；annotation；SB transposon；zebrafish

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0035

2017-01-20

國家自然科學基金項目（31671313，31572364），揚州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)項目（YZ2016040）

劉帥軍，男，碩士研究生，研究方向：動物基因組轉座子基因資源挖掘及其應用；E-mail：971096931@qq.com

宋成義，男，博士，教授，研究方向：動物基因組轉座子基因資源挖掘及其應用；E-mail：cysong@yzu.edu.cn