尚飛能，方海蘭，段寶忠，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100071）

基于ITS2條形碼和化學(xué)指紋鑒別何首烏及其偽品

尚飛能1，方海蘭1，段寶忠1，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100071）

目的：研究何首烏及其偽品的分子和化學(xué)鑒別方法，為其用藥安全提供保障。方法：采用DNA條形碼和高效液相色譜法，比較何首烏及其偽品醬頭ITS2條形碼和HPLC化學(xué)指紋圖譜的差異。結(jié)果：何首烏及醬頭ITS2長度分別為193 bp和206 bp，何首烏種內(nèi)K2P遺傳距離小于醬頭的種間距離，且兩者化學(xué)指紋存在明顯差異。結(jié)論：DNA條形碼和化學(xué)指紋圖譜方法，是鑒別何首烏及偽品的有效手段。

何首烏；偽品；DNA條形碼；化學(xué)指紋；ITS2

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multijiorum Thunb.的干燥塊根，具有解毒、潤腸通便、補肝腎、烏須發(fā)等功效〔1〕，作為大宗常用藥材，被廣泛應(yīng)用在藥品、保健品及日用化工等領(lǐng)域。筆者前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，同屬植物醬頭Polygonum denticulatum C.C. Huang的塊根，在云南藥材市場上常與何首烏互相混用，對臨床用藥安全存在較大的安全隱患。目前，有關(guān)何首烏與混用品醬頭的鑒定僅見外觀性狀、顯微結(jié)構(gòu)、薄層色譜以及trnL-trnF、matK等分子鑒定的相關(guān)報道〔2-4〕，但這些方法易受到生物體生長發(fā)育、外在環(huán)境變化及主觀因素等影響〔5〕。鑒于此，研究DNA條形碼及化學(xué)指紋圖譜法對何首烏及其混用品醬頭的鑒別具有現(xiàn)實意義。

高效液相指紋圖譜方法具有快速，穩(wěn)定，且可直觀的觀察到所檢測樣品成分差異情況的優(yōu)點。近年來，DNA條形碼技術(shù)已成為物種鑒定的研究熱點和傳統(tǒng)鑒別的重要補充〔6〕，同時ITS2條形碼被證實是中藥材鑒定的首選片段，該技術(shù)不受藥材本身性狀和外界因素影響，具有簡便高效、重復(fù)性好、可實現(xiàn)對未知物種的鑒定且鑒定結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點〔7〕。本實驗利用DNA條形碼和高效液相色譜技術(shù)，建立何首烏及其混用品醬頭的鑒別方法，以期為何首烏藥材的用藥安全及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料、儀器與試劑

1.1材料8批藥材樣品購于藥材市場，經(jīng)大理大學(xué)段寶忠副教授鑒定為何首烏Polygonum multiflora Thunb.和醬頭Polygonum denticulatum C.C.Huang。見圖1～2。憑證標(biāo)本保存于大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥標(biāo)本室。同時從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載何首烏和醬頭的ITS2序列各3條。見表1。

表1 樣品及下載序列信息

圖1 何首烏藥材

圖2 醬頭藥材

1.2儀器植物組織研磨儀（Retsch MM400，Ger?many）；PCR儀（Applied Biosystems?，2720，USA）；ABI 3730XL測序儀（Applied Biosystems Co.，USA）。Agi?lent1200高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent Technologies，USA），包括四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、G1314C/DVWD檢測器、Chemstation工作站；Agilent Zorbax SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm，USA）。超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-400KDE）；電子分析天平（AND GH-252）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海市嵩明實驗儀器廠，01A-2B）；中藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司，F(xiàn)Y-135）。

1.3試劑植物組織提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）和2×Taq plus PCR Master Mix均購于北京天根生物技術(shù)有限公司；通用引物ITS2（2F：5’-ATGCGATACTTGGTGAAT-3’，3R：5’-GACCCTT CTCCAGACTACAAT-3’）由北京美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。色譜級甲醇、乙腈（Fisher Scientific，F(xiàn)airlawn New Jersey），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴增、測序和序列分析

2.1.1 DNA提取 分別取何首烏及偽品醬頭藥材根的內(nèi)部約40 mg，用植物組織研磨儀研磨成細(xì)粉（2 min，40 Hz/min）；總DNA提取在植物組織提取試劑盒的基礎(chǔ)上進行了改進。取樣后，使用核分離緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸），pH 8.0；0.7 mmol/L NaCl；2%PVP40（聚乙烯吡咯烷酮40）；2%β-巰基乙醇）抽提2次；水浴溫度為54℃，水浴時間6 h；水浴后，使用氯仿-異戊醇（24∶1）抽提2~3次。采用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）測定A260/A280比值及DNA濃度。

2.1.2 PCR擴增和測序 參考文獻(xiàn)〔8〕方法進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體積為25μL，體系內(nèi)含2×Taq plus PCR Master Mix 12.5μL，上下游引物各1μL（10μmol/L），總DNA 1μL，ddH2O 9.5μL。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性5 min，再進行40個循環(huán)（94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s），最后72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后使用ABI 3730 XL測序儀進行雙向測序。

2.1.3 序列分析 使用序列拼接軟件CodonCode Aligner V 5.1.5（CodonCode Co.，USA）對測序峰圖進行校對和序列拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)。應(yīng)用MEGA 6.05計算種間和種內(nèi)K2P（Kimura 2-parameter）遺傳距離，并構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育聚類樹，利用bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗各分支的支持率。

2.2 HPLC指紋圖譜分析

2.2.1 供試品溶液 取藥材粉末（過40目篩）1 g加入到具塞三角燒瓶中，加甲醇25 mL，精密稱定，超聲提取30 min，冷卻至室溫，用甲醇補足失重，搖勻，過濾，取濾液，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱為Agilent 1 200 series 20RBAX SB-C18柱（5μm，4.6 mm×150 mm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B）；梯度洗脫70 min；0～5 min，5%A；5～10 min，5%～15%A；10～30 min，15%～30%A；30～50 min，30%～70%A；50～65 min，70%～100%A；65～70 min，100%～5%A；流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，進樣量20μL。

3 結(jié)果與分析

3.1 ITS2序列特征和種內(nèi)種間差異分析4份何首烏藥材的ITS2序列的長度均為193 bp，GC含量為79.0%~80.0%，平均GC含量為80.0%。4份醬頭的ITS2序列的長度均為206 bp，GC含量為68.0%~ 70.0%，平均GC含量為69.0%。何首烏種內(nèi)K2P遺傳距離為0.000~0.005，平均距離為0.003。醬頭種內(nèi)K2P遺傳距離為0.005~0.025，平均距離為0.012。何首烏與醬頭種間遺傳距離為1.249~1.294，平均距離為1.260。

3.2 NJ樹結(jié)果分析采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對8份樣本及GenBank下載的6份ITS2序列進行整合分析。結(jié)果表明樣品S1~S4和KM279341、KM279339、KM279338單獨聚為一枝，樣品S5~S8與KM279347、HM357903、EU580714單獨聚為一枝，二者均表現(xiàn)出良好的單系性。見圖3。因此，利用ITS2序列能夠有效的鑒定何首烏與其混用品醬頭。

圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的何首烏及醬頭NJ圖

3.3化學(xué)色譜比較分析按照《中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則》操作，以各峰保留時間計算高效液相色譜方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的RSD值，各值均小于1.21%。8份藥材樣品分別記錄HPLC色譜圖，根據(jù)保留時間標(biāo)定共有色譜峰，兩種藥材的代表色譜圖見圖4，從圖4可看出，在該色譜條件下，何首烏和醬頭化學(xué)色譜圖差異明顯，何首烏的色譜峰明顯多于醬頭，二者僅有4個共有峰，上述結(jié)果表明二者化學(xué)成分差異較大。因此，實際應(yīng)用中，因其外形相似而把醬頭誤作何首烏使用，對臨床用藥安全具有極大隱患。

圖4 何首烏及醬頭藥材HPLC色譜圖

4 結(jié)論

隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)及中藥保健品的迅速發(fā)展，市場對中藥材的供需矛盾加劇，中藥材原材料的真?zhèn)侮P(guān)系到藥品的安全性和有效性，確保中藥材原料的來源可靠，質(zhì)量穩(wěn)定，是當(dāng)前生產(chǎn)中迫切需要解決的問題。本實驗結(jié)果表明，基于ITS2條形碼和化學(xué)指紋圖譜可有效鑒別何首烏藥材及其偽品，二者HPLC指紋圖譜顯示其化學(xué)成分差異顯著，兩者不可替代使用，應(yīng)引起生產(chǎn)者、使用者的注意。DNA條形碼技術(shù)可根據(jù)中藥材DNA分子信息鑒定其物種基原，實現(xiàn)藥材的真?zhèn)舞b定〔9-10〕；化學(xué)指紋圖譜方法可通過指紋圖譜差異對其真?zhèn)芜M行判斷，并可實現(xiàn)成分定量評價藥材質(zhì)量〔11〕。二者相對獨立，結(jié)果可互為補充，其聯(lián)用為易混淆中藥材的真?zhèn)舞b別及生產(chǎn)質(zhì)量控制提供了有效手段。

〔1〕國家藥典委員會.中華人民共和國藥典〔M〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

〔2〕夏從龍，李龍星.何首烏與偽品醬頭的鑒別〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2003，14（9）：540.

〔3〕生書晶，嚴(yán)萍，鄭傳進，等.何首烏及其常見混淆品的matK基因序列分析及鑒別〔J〕.中藥材，2010，33（11）：1707-1711.

〔4〕鄭傳進，生書晶，趙樹進.基于trnL-trnF序列分析的何首烏PCR-RFLP分子鑒別〔J〕.中藥材，2012，35（4）：543-547.

〔5〕方海蘭，夏從龍，段寶忠，等.基于DNA條形碼的中藥材種子種苗鑒定研究：以重樓為例〔J〕.中藥材，2016，39（5）：986-990.

〔6〕陳士林，姚輝，韓建萍，等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則〔J〕.中國中藥雜志，2013，38（2）：141-148.

〔7〕陳士林，姚輝，宋經(jīng)元，等.基于DNA barcoding（條形碼）技術(shù)的中藥材鑒定〔J〕.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9（3）：7-12.

〔8〕CHEN S，YAO H，HAN J，et al.Validation of the ITS2 re?gion as a novel DNA barcode for identifying medicinal plantspecies〔J〕.PLoS ONE，2010，5（1）：8613.

〔9〕熊波，趙志禮，倪梁紅，等.DNA條形碼技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用、局限性與展望〔J〕.中藥材，2015，38（10）：2202-2206.

〔10〕陳士林，郭寶林，張貴君，等.中藥鑒定學(xué)新技術(shù)新方法研究進展〔J〕.中國中藥雜志，2012，37（8）：1043-1055.

〔11〕易倫朝，吳海，梁逸曾.色譜指紋圖譜與中藥質(zhì)量控制〔J〕.色譜，2008，26（2）：166-171.

Identification of Polygonum multiflora and Its Adulterants based on ITS2 Barcode and ChemicalFingerprint

Shang Feineng1,Fang Hailan1,Duan Baozhong1,2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100071,China）

Objective:To develop a rapid identification method to discriminate Polygonum multiflorum and its adulterants,and to guarantee the quality and safety in medication.Methods:DNA barcode and high performance liquid chromatography（HPLC）were used to compare the ITS2 barcode and the HPLC chemical fingerprint between Polygonum multiflorum and Polygonum denticulatum.Results:The ITS2 length of Polygonum multiflorum and Polygonum denticulatum were 193 bp and 206 bp,respectively.The intraspectific K2P genetic distance of Polygonum multiflorum was shorter than the intraspectific distance of Polygonum denticulatum. Furthermore,there were obvious differences between their chemical fingerprints.Conclusion:DNA barcode and chemical fingerprint both can be used to identify Polygonum multiflorum and its adulterants effectively.

Polygonum multiflorum;adulterants;DNA barcode;chemicalfingerprint;ITS2

R282.5

A

2096-2266（2017）04-0012-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.004

（責(zé)任編輯 李 楊）

國家自然科學(xué)基金資助項目（31460084）；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才項目（2015HB058）；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項目（2014Z135）

2016-11-17

2016-12-16

尚飛能，碩士研究生，主要從事中藥資源與鑒定.

*通信作者：段寶忠，副教授.