付文鵬，李永飛，楊秀云，楊 柳，楊永壽

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

云南松松針中黃酮類化合物抗氧化活性研究

付文鵬1，李永飛1，楊秀云1，楊 柳1，楊永壽2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

目的：研究云南松松針中黃酮類化合物的抗氧化活性，為云南松松針的開發(fā)利用提供依據(jù)。方法：用乙醇將干燥、粉碎后的云南松松針進(jìn)行提取、精制、冷凍干燥，得總黃酮提取物；用DPPH法研究云南松松針黃酮類化合物清除自由基的能力，用硫代巴比妥酸法研究云南松松針黃酮類化合物對(duì)大鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的抑制作用。結(jié)果：云南松松針黃酮類化合物對(duì)DPPH自由基有很好的清除作用，能抑制肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。結(jié)論：云南松松針中黃酮類化合物具有較強(qiáng)的體外抗氧化作用。

云南松松針；黃酮類化合物；DPPH自由基；抗氧化

云南松（Pinus yunnanensis Franch.），又稱飛松、青松、長毛松，為松科松屬常綠喬木〔1〕。分布于云南、西藏、四川、貴州等省區(qū)。松針是松科植物的針狀葉，主要含揮發(fā)油、黃酮類（如莽草酸）、木脂素、維生素、氨基酸和多糖等物質(zhì)〔2-3〕。松針的藥用歷史悠久，《本草綱目》記載“松葉，名為松毛，性溫苦，無毒，入肝、腎、肺、脾諸經(jīng)，治各臟腫毒，風(fēng)寒濕疹，久服令人不老，輕身益氣，主治風(fēng)濕瘡；生毛發(fā)，安五臟，守中，不饑延年”〔4〕，民間用來制作松針茶、松針枕。研究表明松針黃酮對(duì)心血管系統(tǒng)疾病有很好的療效，并有很好的抗炎作用〔5〕。近年來，科學(xué)工作者通過研究，分別從銀杏葉、茶葉等植物中提取得到多種黃酮類化合物，并證明黃酮類化合物具有較好的抗脂質(zhì)過氧化和清除體內(nèi)自由基的能力，具有很好的醫(yī)療保健價(jià)值。目前對(duì)云南松松針的研究較少，研究工作者重點(diǎn)集中于對(duì)松塔的研究，并發(fā)現(xiàn)松塔中具有抗HIV活性和對(duì)靜息及致痙離體氣管平滑肌有松弛作用的成分〔6-7〕。本研究擬對(duì)云南松松針中黃酮類化合物進(jìn)行提取、精制，并利用體外模型研究其抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基的能力，以此評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為云南松及其松針的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1材料云南松松針采自云南大理蒼山，除雜后切成5~6 cm長，于60℃干燥16 h〔8〕，粉碎，貯于密封袋中備用。試驗(yàn)用大鼠為SD昆明大鼠，180~220 g，雄性，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（批號(hào)：43004700017373）。

1.2試劑1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：217-591-8）；硫代巴比妥酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150123）；維生素C（上?；瘜W(xué)試劑分裝廠，批號(hào)：15-01-10）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3儀器T-6型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；AL204-IC型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；DFY-200型搖擺高速萬能粉碎機(jī)（浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；D2KW-4型恒溫水浴鍋（上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠）；FDU-2100型冷凍干燥機(jī)（東京理化）；101A-2B電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠）；LC-4012型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1松針中總黃酮的提取取100 g云南松松針粉，用70%乙醇〔8〕90℃下回流提取3次，時(shí)間分別為1.5、1.0、1.0 h。合并提取液，過濾，取濾液減壓濃縮至無醇味，加適量水溶解，用石油醚萃取3次，取水層減壓濃縮，硅膠柱層析洗脫純化，減壓濃縮，冷凍干燥、得松針總黃酮提取物7.16 g，總黃酮提取率為7.16%，密封冷藏保存，備用。

2.2溶液的配制

2.2.1 供試品溶液的配制 精密稱取“2.1”項(xiàng)制備的松針總黃酮提取物適量，用70%乙醇配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液，用70%乙醇稀釋成不同濃度的測試液。

2.2.2 DPPH溶液的配制 精密稱取DPPH 2.2 mg，用無水乙醇配制0.2 mmol/L的溶液，臨用新配。

2.2.3 10%硫代巴比妥酸溶液的配制 精密稱取0.5 g硫代巴比妥酸于50 mL棕色容量瓶中，加少量1 mol/L NaOH溶液溶解，再用10%三氯乙酸定容至刻度，搖勻，即得，臨用新配。

2.2.4 維生素C溶液的配制 精密稱取維生素C 10.0 mg于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解，定容，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的儲(chǔ)備液，臨用新配，用時(shí)用水稀釋成不同濃度的測試液。

2.3清除DPPH能力測定參照文獻(xiàn)方法略作修改〔9〕，實(shí)驗(yàn)在10 mL棕色容量瓶進(jìn)行，分為空白管、對(duì)照管和樣品管。空白管中精密加入1.0 mL樣品溶液和2.0 mL無水乙醇，對(duì)照管中精密加入1.0 mL無水乙醇和2.0 mL DPPH溶液，樣品管中精密加入1.0 mL樣品溶液和2.0 mL DPPH溶液，密塞，混勻，暗處放置30 min，用水定容至刻度，用空白溶劑做參比，于517 nm下測定吸光度值，按下式計(jì)算自由基的清除率：

I（%）=［1－（A樣品－A空白）/A對(duì)照］×100%

2.4抗脂質(zhì)過氧化作用測定將健康大鼠禁食12 h，用乙醚麻醉，迅速取出肝臟，用4℃生理鹽水洗凈血液，吸干水分，切碎，用玻璃勻漿器在冰水浴中研磨制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%大鼠肝勻漿（肝臟：4℃生理鹽水=1：9），3 000 r/min低溫離心10 min，取上清液在冰箱中冷藏備用〔10〕。參照文獻(xiàn)方法略作修改〔10-11〕，實(shí)驗(yàn)分為空白管、對(duì)照管、藥物底管及藥物管?？瞻坠苤芯芗尤?.0 mL生理鹽水和3.0 mL水，對(duì)照管中精密加入肝勻漿2.0 mL和1.0 mL水，藥物底管精密加入1.0 mL樣品溶液、2.0 mL生理鹽水和2.0 mL水，藥物管精密加入1.0 mL樣品溶液、2.0 mL肝勻漿，搖勻，于37℃恒溫水浴振蕩1 h，對(duì)照管和藥物管分別加入10%硫代巴比妥酸溶液2.0 mL，沸水浴加熱15 min，冷卻，3 000 r/min離心10 min，空白校正，取上清液于532 nm處測定吸光度值，平行3份，按下式計(jì)算抑制率：

I（%）=［A對(duì)照-（A藥物管-A藥物底管）］/A對(duì)照×100%

3 結(jié)果

3.1云南松松針黃酮類化合物對(duì)DPPH自由基的清除作用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH自由基）在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，呈紫色，在517 nm處有最大吸收，其濃度與吸光度呈線性關(guān)系。當(dāng)DPPH自由基與抗氧化劑給出的H·結(jié)合，體系顏色變淺，在517 nm處的吸光度值會(huì)降低，通過計(jì)算抗氧化劑對(duì)DPPH的清除率以及清除50%自由基時(shí)的溶液質(zhì)量濃度IC50，來評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化活性。見表1和圖1。

表1 不同濃度云南松松針黃酮和維生素C溶液對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖1 維生素C和云南松松針黃酮對(duì)DPPH自由基清除曲線

由表1和圖1可見，云南松松針黃酮和維生素C溶液對(duì)DPPH自由基都有較強(qiáng)清除能力，但云南松松針黃酮弱于維生素C。通過SPSS 11.0軟件計(jì)算得出云南松松針黃酮和維生素C的IC50分別為0.177 mg/mL和0.033 mg/mL。隨松針黃酮濃度的增大，其自由基清除率也增大，當(dāng)松針黃酮溶液達(dá)到一定濃度時(shí)，清除率達(dá)到最大，并且隨著松針黃酮濃度的增大，清除率不在增加。即云南松松針黃酮溶液濃度達(dá)到0.8 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率最大，表明云南松松針黃酮清除自由基能力在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系。

3.2云南松松針黃酮類化合物抗脂質(zhì)過氧化作用

MDA是一種脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定肝臟受損程度。MDA在酸性和高溫條件下，可以與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成紅棕色的三甲雙酮（3，5，5-三甲基惡唑-2，4-二酮），其最大吸收波長在532 nm。用硫代巴比妥酸法考察抗氧化劑對(duì)MDA的抑制作用，以此評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗脂質(zhì)過氧化能力。測定0.1、1.0、5.0 mg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度的云南松松針黃酮溶液對(duì)大鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的抑制作用。見表2。

不同質(zhì)量濃度的云南松松針黃酮溶液均可抑制大鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并且隨著藥物濃度增加，抑制作用也逐漸增強(qiáng)。云南松松針黃酮溶液的濃度為0.1 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到66.36%，可以看出其具有較好的抗脂質(zhì)過氧化的能力。

表2 云南松松針黃酮類化合物對(duì)大鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響（

表2 云南松松針黃酮類化合物對(duì)大鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響（

樣品 濃度/（mg/m L） 抑制率/%對(duì)照管 — —0.1 66.36±0.06云南松松針黃酮溶液1.0 68.93±1.20 5.0 74.33±1.39

4 討論

近年來，科學(xué)工作者通過研究，證明天然黃酮類化合物具有較好的抗脂質(zhì)過氧化和清除體內(nèi)自由基的能力。王潤豐等〔12〕從野生卷丹百合中提取的黃酮類化合物，質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到47.45%；方玉梅等〔13〕從食用甜蕨及苦蕨中提取的黃酮類化合物，質(zhì)量濃度為12.283μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到87.13%和50.21%；黃元慶等〔14〕對(duì)枸杞總黃酮類化合物抗脂質(zhì)過氧化的研究中，當(dāng)枸杞總黃酮濃度在0.025~2.000 mg/mL范圍時(shí)，對(duì)MDA的抑制率為38.38%~99.96%。而云南松松針黃酮溶液的質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)78.67%；云南松松針黃酮溶液質(zhì)量濃度在0.1~ 5.0 mg/mL范圍時(shí)，對(duì)MDA的抑制率為66.36%~ 74.33%。雖然云南松松針黃酮類化合物清除自由基的能力稍弱于維生素C，但比上文提到的幾種天然黃酮類化合物都較強(qiáng)，其抗脂質(zhì)過氧化作用的效果較好，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。

目前，對(duì)云南松松針的利用僅限于作燃料或肥料，而云南松松針資源非常豐富，可反復(fù)再生利用。研究表明，云南松松針中黃酮類化合物的含量較高，提取率達(dá)到7.16%。實(shí)驗(yàn)證明云南松松針中黃酮類化合物有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化和清除體內(nèi)自由基的作用，說明云南松松針在保健品開發(fā)方面具有很高的潛力。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)云南松松針抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，而其抗氧化活性與治療疾病之間的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

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Antioxidant Effectof Flavonoids Compounds from Pine Needles of Pinus yunnanensis Franch

Fu Wenpeng1,Li Yongfei1,Yang Xiuyun1,Yang Liu1,Yang Yongshou2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Key Laboratory of Pharmaceutical R&D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the antioxidant activity of flavonoids compounds from pine needles of Pinus yunnanensis Franch and to provide the basis for the utilization of pine needles of Pinus yunnanensis Franch.Methods:Extraction,purification and freezedrying treatments were carried out with ethyl alcohol for dried and grinded pine needles of Pinus yunnanensis Franch;thus total flavonoid extracts were obtained.DPPH was used to study the ability of scavenging free radicals of flavonoids from pine needles of Pinus yunnanensis Franch.TBA was used to study the inhibiting effectofflavonoids from pine needles of Pinus yunnanensis Franch on MDA in the mice liver tissue homogenate.Results:Flavonoids from pine needles of Pinus yunnanensis Franch had scavenging effect on DPPH and could inhibit the generation of spontaneous liver homogenate lipid peroxidation MDA.Conclusion:The flavonoids from pine needles of Pinus yunnanensis Franch had a strong anti-oxidanteffect.

pine needles of Pinus yunnanensis Franch;flavonoids;DPPH;antioxidation

R285

A

2096-2266（2017）04-0032-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.009

（責(zé)任編輯 李 楊）

大理大學(xué)大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（KYSX2015105）；大理大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（CXCY201616）

2016-06-12

2016-09-13

付文鵬，2013級(jí)藥學(xué)專業(yè)本科生.

*通信作者：楊永壽，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師.