邱 琳，肖朝江，董 相，姜 北*

（1.大理大學(xué)藥物研究所，云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

長果頸黃芪根中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究

邱 琳1，2，肖朝江1，2，董 相1，2，姜 北1，2*

（1.大理大學(xué)藥物研究所，云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：對長果頸黃芪（Astragalus englerianus）根化學(xué)成分進(jìn)行研究，并對分離得到的化合物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性測試。方法：利用Rp-18、Sephadex LH-20、硅膠等分離手段對長果頸黃芪根部分的甲醇提取物進(jìn)行分離純化，通過現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù)對相關(guān)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）為底物的酶抑制劑篩選模型對各樣品進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：從該植物根甲醇提取物的乙酸乙酯部位分離得到6個化合物，分別鑒定為：十六烷酸單甘油酯（1）、2，4'-二羥基-4-甲氧基二氫查耳酮（2）、胡蘿卜苷（3）、5α，6β-二羥基胡蘿卜苷（4）、（3R）-vestitol-7-O-glucoside（5）、（2S，3S，4R，8E）-2-［（2'R）-2'-羥基-二十四烷酰胺］-8-十八烯-1，3，4-三醇（6）。α-葡萄糖苷酶抑制活性結(jié)果顯示，化合物2具有顯著抑制活性，IC50顯著小于陽性對照阿卡波糖；化合物5及其苷元（3R）-vestitol也顯示一定的抑制活性。結(jié)論：化合物1~6均為首次從長果頸黃芪根中分離得到，其中黃酮類成分對α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制活性。

長果頸黃芪；根；化學(xué)成分；α-葡萄糖苷酶；抑制活性

長果頸黃芪（Astragalus englerianus）為我國特有的豆科黃芪屬植物，主要分布于云南、西藏東南部等地區(qū)，生于海拔2 000～3 700 m的山坡林緣。民間藥用記載該植物根入藥，有滋腎補(bǔ)脾、止汗利水、消腫化膿之效〔1-2〕。為了解該植物的化學(xué)成分與生物活性，本研究團(tuán)隊(duì)曾對該植物進(jìn)行過系統(tǒng)的研究，分離得到了一系列結(jié)構(gòu)類型多樣的活性成分〔3-4〕。由于黃芪屬植物多具有血糖調(diào)節(jié)作用，為該研究的后續(xù)工作，近來我們對長果頸黃芪地下部分甲醇提取物乙酸乙酯部位進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶抑制活性成分研究，從中分離鑒定了6個化合物，分別為：十六烷酸單甘油酯（1）、2，4'-二羥基-4-甲氧基二氫查耳酮（2）、胡蘿卜苷（3）、5α，6β-二羥基胡蘿卜苷（4）、（3R）-vestitol-7-O-glucoside（5）、（2S，3S，4R，8E）-2-［（2'R）-2'-羥基-二十四烷酰胺］-8-十八烯-1，3，4-三醇（6）。見圖1?；钚詼y試結(jié)果顯示，化合物2對α-葡萄糖苷酶有很好的抑制活性，IC50顯著小于陽性對照阿卡波糖，化合物5及其苷元（3R）-vestitol也顯示一定的抑制活性。本研究為長果頸黃芪的開發(fā)利用提供了初步的基礎(chǔ)性研究依據(jù)。

圖1 化合物1~6的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)用植物樣品于2011年11月采自云南省大理市蒼山東坡，由中國科學(xué)院昆明植物研究所向春雷博士鑒定為長果頸黃芪Astragalus englerianus Ulbr.，植物標(biāo)本（編號：20100928-1b）現(xiàn)存放于大理大學(xué)藥物研究所姜北教授研究組〔3〕。

1.2儀器與試劑Bruker Avance III-400核磁共振波譜儀（TMS為內(nèi)標(biāo)）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-210（BUCHI）；BioTek Synergy HT酶標(biāo)儀（BioTek Instruments Inc.）；RP-18（40～75μm，日本Fuji公司）；Sephadex LH-20（Amersham Biosciences）；柱色譜硅膠與薄層色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）；α-Glucosidase from rice（G9259-100UN）和4-Nitrophenylα-D-glucopyrano?side（N1377-1G）均購于Sigma公司；阿卡波糖（北京百靈威科技有限公司）；氯仿、丙酮、甲醇等試劑均為工業(yè)級有機(jī)溶劑，經(jīng)重蒸后使用；其余試劑均為分析純；供試樣品（3R）-vestitol由本研究組前期研究中分離得到〔5〕。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1提取分離長果頸黃芪干燥根（6.1 kg）粉碎后用甲醇室溫冷浸提取6次，減壓濃縮所得總浸膏用適量水混懸后依次用乙酸乙酯、正丁醇分配數(shù)次；乙酸乙酯部分減壓濃縮得浸膏100 g，與適量粗硅膠（80~100目）混合拌樣后經(jīng)200~300目硅膠柱色譜，氯仿-丙酮混合溶劑梯度洗脫（1：0至0：1），經(jīng)TLC（薄層色譜法）檢測合并相同流分得10個組分（A~J）〔3〕。組分D經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿：甲醇= 1：1）柱層析以及硅膠柱層析（石油醚-乙酸乙酯）得到化合物1（22.6 mg）。組分E經(jīng)硅膠柱層析（氯仿-甲醇），Sephadex LH-20（氯仿：甲醇=1：1）柱層析和Rp-18（甲醇-水）柱層析得到化合物2（41.1 mg）、3（277.0 mg）和4（34.3 mg）。組分F經(jīng)大孔樹脂（甲醇-水）、Sephadex LH-20（氯仿：甲醇=1：1）柱層析以及反復(fù)硅膠柱層析（氯仿-丙酮、氯仿-甲醇）的方法得到化合物5（121.4 mg）、6（56.0 mg）。

2.2α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定α-葡萄糖苷酶抑制活性測定的反應(yīng)體系參照MA等〔6〕的方法，并略有改進(jìn)：分別配制100 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.0）、2 mmol/L PNPG溶液（PBS溶解）、0.3 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液（PBS溶解）以及0.2 mol/L Na2CO3溶液；測試樣品根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果用DMSO（二甲基亞砜）配置成合適的初始濃度，共設(shè)置5個濃度梯度，采用倍比稀釋法稀釋成測試濃度；取96孔板，每孔加40μL的PNPG溶液和5μL樣品溶液，震板30 s后加入5μL的α-葡萄糖苷酶溶液，在37℃恒溫水浴20 min，加入50μL的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，冷卻至室溫后在酶標(biāo)儀下以405 nm為測定波長，630 nm為參比波長測定吸收值并按下式計(jì)算抑制率。實(shí)驗(yàn)一式5份，同時設(shè)置空白對照（DMSO）和陽性對照（阿卡波糖）。

抑制率%=［（△A空白-△A樣品）/△A空白］×100%；△A=樣品組OD值-背景組OD值

2.3數(shù)據(jù)處理方法采用SPSS 7.0統(tǒng)計(jì)軟件對活性測試結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1結(jié)構(gòu)鑒定化合物1：白色粉末。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：2.37（2H，t，J=7.42 Hz，H-2），1.62（2H，brs，H-3），1.29（16H，brs，H-4~15），4.16（1H，dd，J=11.4，4.4 Hz，H-1'a），4.07（1H，dd，J=11.4，6.3 Hz，H-1'b），3.85（1H，m，H-2'），3.57（1H，d，J=5.9 Hz，H-3'a），3.31（1H，d，J=5.7 Hz，H-3'b），0.90（3H，t，J=6.2 Hz，Me-16）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：175.8（s，C-1），35.2（t，C-2），33.2（t，C-3），30.2~30.3（t，C-4~14），23.9（t，C-15），14.8（q，C-16）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔7〕報道的碳、氫譜數(shù)據(jù)基本一致，取標(biāo)準(zhǔn)品十六烷酸單甘油酯點(diǎn)板對照，其Rf值與斑點(diǎn)顏色均與標(biāo)準(zhǔn)品一致，故確定化合物1為十六烷酸單甘油酯。

化合物2：淺黃色粉末。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.87（2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6'），6.84（1H，d，J=8.4 Hz，H-6），6.84（2H，d，J=8.8 Hz，H-3'，5'），6.50（1H，d，J=2.6 Hz，H-3），6.44（1-H，dd，J=8.4，2.6 Hz，H-5），3.73（3H，s，H-OCH3），3.34（2H，t，J=5.6Hz，H-α），2.92（2H，t，J=5.6 Hz，H-β）；13CNMR（100 MHz，CDCl3）δ：120.3（s，C-1），155.3（s，C-2），102.8（d，C-3），159.6（s，C-4），107.1（d，C-5），131.1（d，C-6），128.9（s，C-1'），131.1（d，C-2'，C-6'），115.5（d，C-3'，C-5'），161.2（s，C-4'），201.2（s，C=O），40.2（t，C-α），22.9（t，C-β），55.3（q，OCH3）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔8〕報道的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故確定化合物2為2，4'-二羥基-4-甲氧基二氫查耳酮。

化合物3：白色粉末。1H NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.36（1H，d，J=4.3 Hz，H-6），5.03（1H，d，J=7.7 Hz，H-1'），4.58（1H，dd，J=12.2，2.5 Hz，H-6'a），4.43（1H，dd，J=12.2，5.2 Hz，H-6'b），4.29（1H，d，J=6.8 Hz，H-4'），0.93（1H，d，J=6.6 Hz，Me-21），0.89（3H，s，Me-19），0.85，0.81 and 0.79（each 3H，overlap，Me-26，27 and 29），0.67（3H，s，Me-18）；13C NMR（100 MHz，C5D5N）δ：37.9（t，C-1），30.8（t，C-2），78.9（d，C-3），40.6（t，C-4），141.2（s，C-5），122.4（d，C-6），32.7（t，C-7），32.6（d，C-8），50.8（d，C-9），37.4（s，C-10），21.8（t，C-11），39.8（t，C-12），42.9（s，C-13），57.3（d，C-14），24.9（t，C-15），29.1（t，C-16），56.7（d，C-17），12.5（q，C-18），19.7（q，C-19），36.9（d，C-20），19.5（q，C-21），34.7（t，C-22），26.9（t，C-23），46.5（d，C-24），29.9（d，C-25），20.5（q，C-26），19.9（q，C-27），23.9（t，C-28），12.7（q，C-29），103.1（d，C-1'），75.8（d，C-2'），78.6（d，C-3'），72.0（d，C-4'），79.1（d，C-5'），63.3（t，C-6'）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔9〕報道的波譜數(shù)據(jù)一致，故確定化合物3為胡蘿卜苷。

化合物4：白色粉末。1H NMR（400 MHz，C5D5N）δ：4.88（1H，d，J=7.5 Hz，H-1'），4.38（1H，dd，J=12.1，2.3 Hz，H-6'a），4.29（1H，dd，J=12.1，4.8 Hz，H-6'b），4.25（1H，t，J=9.0 Hz，H-4'），4.16（1H，t，J=8.9 Hz，H-3'），4.11（1H，brs，H-6），2.98（1H，dd，J=12.1，4.5 Hz，H-4a），2.58（1H，m，H-4b），1.33（3H，s，Me-19），0.96（3H，m，Me-21），0.87（3H，m，Me-27），0.80（3H，m，Me-26），0.66（3H，s，Me-18）；13C NMR（100 MHz，C5D5N）δ：33.3（t，C-1），31.9（t，C-2），75.9（d，C-3），39.3（s，C-4），76.2（s，C-5），76.5（d，C-6），36.4（d，C-7），31.6（t，C-8），46.2（d，C-9），39.3（t，C-10），23.2（t，C-11），41.4（t，C-12），43.4（t，C-13），57.2（d，C-14），25.1（d，C-15），30.0（d，C-16），56.9（d，C-17），12.4（q，C-18），17.4（q，C-19），37.2（s，C-20），19.4（q，C-21），34.7（t，C-22），27.3（t，C-23），46.2（t，C-24），30.1（t，C-25），19.9（q，C-26），20.5（t，C-27），23.9（t，C-28），12.7（C-29），102.9（d，C-1'），75.3（d，C-2'），76.9（d，C-3'），72.5（d，C-4'），77.9（d，C-5'），63.3（t，C-6'）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔10〕報道的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故確定化合物4為5α，6β-二羥基胡蘿卜苷。

化合物5：針狀結(jié)晶（甲醇）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.95（1H，d，J=8.5 Hz，H-6'），6.94（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），6.59（1H，dd，J=8.4，2.4 Hz，H-5'），6.53（1H，d，J=2.4 Hz，H-3'），6.36（1H，dd，J=8.4，2.5 Hz，H-6），6.33（1H，d，J=2.5 Hz，H-8），4.81（1H，d，J=7.4 Hz，H-1''），4.20（1H，ddd，J=10.3，3.4，1.9 Hz，H-2a），3.96（1H，d，J=10.3 Hz，H-2b），3.86（1H，d，J=1.9 Hz，H-6'），3.70（3H，s，-OMe），3.86（1H，d，J=4.8 Hz，H-5''），2.94（1H，dd，J=15.8，10.8 Hz，H-4a），2.80（1H，ddd，J=15.8，5.3，1.9 Hz，H-4b）；13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：71.1（t，C-2），33.0（d，C-3），31.4（t，C-4），131.2（d，C-5），110.1（d，C-6），158.3（s，C-7），105.6（d，C-8），156.3（s，C-9），117.9（s，C-10），121.1（s，C-1'），157.2（s，C-2'），102.4（d，C-3'），160.8（s，C-4'），105.7（d，C-5'），128.8（d，C-6'），55.6（q，-OMe），102.4（d，C-1''），74.9（d，C-2''），78.0（d，C-3''），71.3（d，C-4''），78.1（d，C-5''），62.5（t，C-6''）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔11〕報道的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故確定化合物5為（3R）-vestitol-7-O-glucoside。

化合物6：白色粉末。1H NMR（400 MHz，C5D5N）δ：8.60（1H，d，J=9.0 Hz，NH），5.54（2H，m，H-8，9），5.13（1H，m，H-2），4.64（1H，dd，J=7.8，3.8 Hz，H-2'），4.53（1H，dd，J=10.8，4.6 Hz，H-1a），4.44（1H，dd，J=10.8，4.9 Hz，H-1b），4.35（1H，dd，J=6.9，4.4 Hz，H-3），4.30（1H，m，H-4），1.16~2.36（m，H-11~17，5'~23'），0.88（6H，t，J= 7.0 Hz，H-18，24'）；13C NMR（100 MHz，C5D5N）δ：61.8（t，C-1），52.7（d，C-2），76.6（d，C-3），72.6（d，C-4），33.6（t，C-5），26.5（t，C-6），32.8（t，C-7），130.4（d，C-8），130.6（d，C-9），33.1（t，C-10），29.3-29.8（t，C-11~15），31.9（t，C-16），22.7（t，C-17），14.1（q，C-18），175.0（s，C-1'），72.2（d，C-2'），35.5（t，C-3'），25.6（d，C-4'），29.3-29.8（t，C-5'~21'），31.9（t，C-22'），22.7（t，C-23'），14.1（q，C-24'）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔12〕報道的波譜數(shù)據(jù)基本一致，并取標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)板對照，以3個不同的溶劑系統(tǒng)分別展開，其Rf值與斑點(diǎn)顏色均與標(biāo)準(zhǔn)品一致，故確定化合物6為（2S，3S，4R，8E）-2-［（2'R）-2'-羥基-二十四烷酰胺］-8-十八烯-1，3，4-三醇。

3.2受試樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定結(jié)果

對長果頸黃芪根甲醇提取物、提取物乙酸乙酯萃取部位、化合物1~6及化合物5的苷元（3R）-vestitol進(jìn)行α-葡萄糖苷酶的抑制活性檢測，其中甲醇提取物、乙酸乙酯部分初始濃度為5 mg/L，各單體化合物初始濃度為1 mg/L，在初始濃度下仍未顯示出對α-葡萄糖苷酶有抑制活性，則認(rèn)為該化合物沒有活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：類屬于黃酮的化合物2活性最好，化合物5的苷元（3R）-vestitol次之，化合物5活性較弱，其余化合物均沒有顯示對α-葡萄糖苷酶有抑制活性，相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果見表1。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)從長果頸黃芪中分離得到的6個化合物，結(jié)構(gòu)類型涉及黃酮、甾體、酰胺和酯類成分等。α-葡萄糖苷酶抑制活性測試結(jié)果顯示，僅黃酮類化合物具有抑制活性，而酯類、甾體類及酰胺都不具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。同時，化合物5的α-葡萄糖苷酶抑制活性明顯弱于相應(yīng)苷元（3R）-vestitol，說明其結(jié)構(gòu)中的酚羥基被糖基化后會降低化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，這與文獻(xiàn)〔13〕報道相一致?；衔?為二氫查耳酮類化合物，TSUJIHARA等研究發(fā)現(xiàn)同類化合物根皮苷及其衍生物具有抑制鈉糖轉(zhuǎn)運(yùn)通道（SGLT）活性〔14〕。這類化合物可以通過抑制SGLT活性，促進(jìn)尿糖代謝，從而達(dá)到降低血糖的目的。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果進(jìn)一步顯示二氫查耳酮類化合物也可與α-葡萄糖苷酶的活性位點(diǎn)相結(jié)合，從而達(dá)到抑制其活性的目的。

表1 受試樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

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Study on the Compoundswithα-Glucosidase Inhibitory Activity from Roots of Astragalus englerianus

Qiu Lin1,2,Xiao Chaojiang1,2,Dong Xiang1,2,Jiang Bei1,2*
（1.Institute of Materia Medica of DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000,China;2.College of Pharmacy and Chemistry, Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the chemical components of Astragalus englerianus,and to explore the active compounds ofαglucosidase's inhibiting from the roots of Astragalus englerianus.Methods:The compounds were isolated and purified by Rp-18, Sephadex LH-20 and silica gel column chromatography.Their structures were identified by modern spectroscopy techniques. Theα-glucosidase's inhibiting experiment was performed by using enzyme inhibitor screening model with 4-nitrophenolα-D-glucopyranoside（PNPG）as the substrate.Results:Six compounds were isolated from ethyl acetate fraction of methanol extract of the roots of A.englerianus and identified as 1-O-hexadecanolenin（1）,2,4'-dihydroxy-4-methoxy dihydrochalcone（2）, daucosterol（3）,5α,6β-dihydroxy-daucosterol（4）,（3R）-vestitol-7-O-glucoside（5）,and（2S,3S,4R,8E）-2-［（2'R）-2-hydroxytetracosanoylamino］-1,3,4-octadecanetriol-8-ene（6）.All of these compounds were examined for theirα-glucosidase inhibitory activities.As a result,compound 2 showed significantly activity with the lower IC50than the positive control,acarbose. Compound 5 and its aglucon,（3R）-vestitol also showed some inhibitory activity.Conclusion:Allofthe compounds were isolated from the roots of A.englerianus for the first time,and the flavonoids showed the betterα-glucosidase inhibitory activity than the other compounds.

Astragalus englerianus;root;compounds;α-glucosidase;inhibitory activity

R932

A

2096-2266（2017）04-0001-05

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.001

（責(zé)任編輯 李 楊）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31170313）

2016-08-16

2016-12-23

邱琳，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物研究.

*通信作者：姜北，教授，博士.