高 波，孫晶晶，段月勛，鄧 剛，楊 倩，王 霖，潘 云*

（1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650100；3.云南省傳染病專科醫(yī)院，昆明 650301；4.昆明市第一人民醫(yī)院，昆明 650000；5.昆明市傳染病醫(yī)院，昆明 650200）

艾滋病相關(guān)DLBCL中EB病毒的感染情況分析

高 波1，孫晶晶2，段月勛3，鄧 剛1，楊 倩4，王 霖5，潘 云1*

（1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650100；3.云南省傳染病?？漆t(yī)院，昆明 650301；4.昆明市第一人民醫(yī)院，昆明 650000；5.昆明市傳染病醫(yī)院，昆明 650200）

目的：分析艾滋病相關(guān)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（AIDS/HIV-related diffuse large B-celllymphoma，HIV-DLBCL）中EB病毒的感染狀況，并探討其在HIV-DLBCL中的作用。方法：收集20例HIV-DLBCL組織作為實(shí)驗(yàn)組，5例非HIV感染的DLBCL（non-HIV-DLBCL）、4例HIV陽性淋巴結(jié)反應(yīng)性增生（HIV-reactive hyperplasia，HIV-RH）、5例HIV陰性RH（non-HIV-RH）均作為對(duì)照組。采用原位雜交的方法對(duì)EBER（EB病毒編碼的小RNA）的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：HIV-DLBCL中EBER的總陽性率為30%（6/20）；non-HIV-DLBCL中EBER的陽性率為40%（2/5）；HIV-RH和non-HIV-RH中EBER均呈陰性。結(jié)論：EBV感染與部分DLBCL的發(fā)生有關(guān)，但EBV在HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL中的作用是否具有差異還需進(jìn)一步深入研究。

艾滋病相關(guān)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤；EB病毒；EBER

獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immune Defi?ciency Syndrome，AIDS），即艾滋病，是指人體感染人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）后，造成機(jī)體免疫功能嚴(yán)重受損，發(fā)生機(jī)會(huì)性感染和惡性腫瘤等一系列臨床表現(xiàn)的綜合征。艾滋病相關(guān)淋巴瘤（AIDS-related lymphoma，ARL）是一組與HIV感染相關(guān)的異質(zhì)性淋巴造血組織增殖性疾病，其本質(zhì)為免疫細(xì)胞的惡變〔1〕。流行病學(xué)資料顯示，與普通人群相比，非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）的發(fā)病率在HIV陽性患者中顯著升高，比非HIV感染者發(fā)生NHL的機(jī)率高60~200倍〔2-3〕。ARL已逐漸取代Kaposi肉瘤，成為最常見的AIDS相關(guān)惡性腫瘤〔4〕。ARL的常見病理類型以中度惡性的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-celllymphoma，DLBCL）和高度惡性的伯基特淋巴瘤（Burkittlymphoma，BL）為主，約占95%以上，還有一些罕見的亞型〔5〕。

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)172 kb，屬于人類皰疹病毒科γ亞科，具有嗜人類淋巴細(xì)胞的特性〔6-7〕。EBV在全世界的感染率高達(dá)90%，大多數(shù)人終身潛伏感染，機(jī)體免疫功能明顯下降等少數(shù)情況下，免疫系統(tǒng)和病毒之間的平衡失調(diào)，則可能引起惡性的淋巴細(xì)胞增殖性疾病。近年研究發(fā)現(xiàn)EB病毒與霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL）、Burkitt淋巴瘤、NK/T細(xì)胞淋巴瘤等關(guān)系密切，EBV陽性的淋巴瘤被稱為EBV相關(guān)淋巴瘤〔8〕。張彥等〔9〕用EB病毒液在體外感染人外周血淋巴細(xì)胞，成功建立淋巴母細(xì)胞株，并發(fā)現(xiàn)EB病毒相關(guān)淋巴母細(xì)胞在免疫缺陷小鼠中具有致瘤性。EBV潛伏感染時(shí)，其DNA整合于宿主細(xì)胞核內(nèi)，不表達(dá)或部分低表達(dá)，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，EBV變異株再感染，使大量EBV-DNA克隆片段整合至宿主DNA上，促進(jìn)宿主細(xì)胞異常增殖，最終導(dǎo)致癌變。在BL、DLBCL、PCNSL、KSHV（+）PEL等淋巴瘤中均有不同程度的EBV感染，感染率約為60%~100%〔10〕。EBV陽性淋巴瘤臨床過程呈侵襲性，預(yù)后差〔11〕。

鑒于云南省為HIV感染的高發(fā)省份，探究ARL的發(fā)病機(jī)制十分必要，因此我們采用原位雜交的方法檢測(cè)HIV-DLBCL組織中EBER（EBV編碼的小RNA）的表達(dá)，探討EBV感染與HIV-DLBCL的發(fā)生是否存在相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本收集2008至2013年度云南省多家醫(yī)院（大理大學(xué)附屬醫(yī)院、云南省傳染病醫(yī)院、昆明市傳染病醫(yī)院等）的艾滋病相關(guān)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（AIDS/HIV-related diffuse large B-cell lymphoma，HIV-DLBCL）手術(shù)或活檢石蠟包埋標(biāo)本20例。對(duì)照組14例石蠟包埋標(biāo)本也收集自上述醫(yī)院，分為3組，其中A組為5例非HIV感染的DLBCL（non-HIV-DLBCL），B組為4例HIV陽性淋巴結(jié)反應(yīng)性增生（HIV-reactive hyperplasia，HIV-RH），C組為5例non-HIV-RH。20例HIV-DLBCL和5例non-HIV-DLBCL患者入院前均未進(jìn)行治療。按照2008年WHO關(guān)于淋巴造血組織腫瘤的分類標(biāo)準(zhǔn)，由大理大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2名高年資病理醫(yī)生對(duì)HE切片進(jìn)行復(fù)核。

1.2主要試劑EBER原位雜交試劑盒購自福建泰普生物科學(xué)有限公司；蘇木素、伊紅購自美國Sigma公司；二甲苯、無水乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、甲醛等試劑均購自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.3核酸原位雜交標(biāo)本均以4μm連續(xù)切片，65℃恒溫箱中烤片1 h，按照EBER原位雜交試劑盒的說明檢測(cè)EB病毒小RNA。以PBS代替雜交液做陰性對(duì)照，選用EB病毒陽性的鼻咽癌組織切片作陽性對(duì)照。

1.4結(jié)果判讀EBER原位雜交陽性表達(dá)定位于胞核，呈棕黃色細(xì)顆粒狀，陽性細(xì)胞比例≥5%為陽性，<5%為陰性。胞質(zhì)和胞膜著色視為陰性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)相關(guān)計(jì)數(shù)資料分析采用Fisher確切概率法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1臨床資料分析20例HIV-DLBCL患者的臨床特點(diǎn)：男性15例，女性5例，男：女比例為3：1；年齡范圍29~66歲，中位年齡50歲，其中大于60歲者4例，占20%，小于等于60歲者16例，占80%，兩者之比約為0.25：1；原發(fā)于結(jié)內(nèi)者14例，占70%，原發(fā)于結(jié)外者6例，占30%，兩者之比約2.3：1；其中結(jié)內(nèi)原發(fā)于頸部淋巴結(jié)7例（7/14），腋窩淋巴結(jié)2例（2/14），腹股溝淋巴結(jié)者4例（4/14），其他部位淋巴結(jié)1例（14/14），結(jié)外原發(fā)于胃腸道5例（5/6），睪丸1例（1/6）；免疫分型：GCB型5例，占25%，nonGCB型15例，占75%；臨床分期早期（Ⅰ+Ⅱ）者7例（7/20），占35%，進(jìn)展期（Ⅲ+Ⅳ）13例（13/20），占65%，兩者之比約為0.54：1。20例HIV抗體確認(rèn)實(shí)驗(yàn)均呈陽性。

對(duì)照組14例，男性9例，女性5例，男：女比為1.8：1；年齡27~72歲，中位年齡47.5歲。對(duì)照組：A組5例non-HIV-DLBCL，淋巴結(jié)內(nèi)病變3例（頸部、腋下及后腹膜等處淋巴結(jié)），結(jié)外病變2例（頜下及大腿根部等處腫物）；B組4例HIV-RH，均為頸部淋巴結(jié)病變組織；C組5例non-HIV-RH，頸部淋巴結(jié)病變組織4例，腹股溝淋巴結(jié)病變組織1例。

2.2 EBER在各組樣本中的表達(dá)情況20例HIVDLBCL中EBER總陽性率為30%（6/20）。對(duì)照組14例樣本中EBER總陽性率為14.29%（2/14），A組5例non-HIV-DLBCL中EBER陽性率為40%（2/5），B組4例HIV-RH和C組5例non-HIV-RH中EBER均呈陰性。HIV-DLBCL與non-HIV-DLBCL中EBER的表達(dá)率明顯高于HIV-RH和non-HIV-RH，表明EBV感染與部分DLBCL的發(fā)生有關(guān)。見表1、圖1。

表1 EBER在各組樣本中的表達(dá)情況

圖1 免疫組化法檢測(cè)HIV-DLBCL中EBER陽性表達(dá)（核陽性）400x

EBER在HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL中均有表達(dá)，但表達(dá)率較低，兩組腫瘤中EBER總陽性率為32%。HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL中EBER表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）。見表2。

何萬貫（2007）認(rèn)為，寫作是一個(gè)過程，包含第一寫作過程和第二寫作過程。前者指學(xué)生收到寫作任務(wù)，完成后上交作文的過程；后者指學(xué)生收到批改過的作文并根據(jù)評(píng)語修改的過程。在第二寫作過程中，學(xué)生要分析并理解評(píng)語和反饋信息，重新組織與修改作文。這是一項(xiàng)高級(jí)認(rèn)知活動(dòng)，對(duì)提高作文質(zhì)量至關(guān)重要（何萬貫，2007）。

表2 HIV/non-HIV-DLBCL組間EBER表達(dá)情況

3 討論

DLBCL是臨床特點(diǎn)、組織形態(tài)、免疫表型及分子遺傳學(xué)特征具有多樣性的侵襲性淋巴瘤，其分子發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜。與non-HIV-DLBCL相比，HIV-DLBCL在臨床上表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性。HIV感染有關(guān)的淋巴瘤更傾向于復(fù)雜的淋巴結(jié)外病變，部分ARL患者出現(xiàn)一些特殊部位的侵犯，如肺、口腔、腎上腺、腎臟、心臟、膽囊、耳垂及其他淋巴瘤可涉及的復(fù)雜部位都有報(bào)道〔12〕。

EBV的致癌機(jī)制仍未完全闡明，目前研究認(rèn)為可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)：①EBV對(duì)被其感染的B細(xì)胞有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力或永生化能力；②某些相關(guān)因素，如特異性免疫識(shí)別或免疫監(jiān)視功能喪失、其他病原體感染激活B細(xì)胞異常增殖以及與環(huán)境因素等協(xié)同作用；③EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞出現(xiàn)繼發(fā)性基因突變或染色體易位等變化〔13〕。EBV在不同研究中表達(dá)率存在差異，盧璐等〔6〕發(fā)現(xiàn)EBER1在DLBCL中的陽性率為25.0%。孫文文等〔7〕對(duì)EBV Lmp-1蛋白與EBER1 mRNA在DLBCL中的陽性率僅為0.94%、5.7%。Castillo等〔14〕認(rèn)為EBV陽性的DLBCL患者應(yīng)該按照類似EBV陰性DLBCL患者的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期和管理，經(jīng)化療免疫治療后，EBV陽性患者的預(yù)后更差。Tisi等〔15〕對(duì)218例DLBCL患者的全血樣本進(jìn)行分析，在25%的患者全血中檢測(cè)到EBVDNA，EBV陽性患者經(jīng)R-CHOP免疫化療后，無進(jìn)展生存期和總生存期都明顯短于EBV陰性的患者。

AIDS相關(guān)淋巴組織增殖性疾病是一組出現(xiàn)在HIV感染伴隨免疫抑制狀態(tài)下的疾病，受EBV感染的淋巴細(xì)胞可以發(fā)生無限制的增殖。Martorelli等〔16〕證實(shí)HIV-1基質(zhì)蛋白p17由被感染的細(xì)胞釋放并在淋巴組織中積累，可以與細(xì)胞受體CXCR1和CXCR2結(jié)合，B淋巴細(xì)胞中EBV感染或EBV LMP-1異位表達(dá)均可以上調(diào)CXCR2，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)p17結(jié)合和內(nèi)化作用，同時(shí)在免疫缺陷群體中p17對(duì)EBV誘導(dǎo)的淋巴瘤發(fā)生具有促進(jìn)作用。在30%~70%的HIV相關(guān)淋巴瘤病例中，可以檢測(cè)到EBV基因組，并且兩者的關(guān)系程度與淋巴瘤的組織病理類型相關(guān)〔17-18〕。PCNSL、免疫母細(xì)胞性（DLBCL）、PEL及其變異型、口腔PBLs等，均呈現(xiàn)EBV感染的特征〔2〕。

本研究結(jié)果與多數(shù)報(bào)道一致：EBV在HIVDLBCL中的表達(dá)率為30%，在non-HIV-DLBCL中的表達(dá)率為40%，與淋巴結(jié)良性病變組織中EBER的表達(dá)率具有明顯差異，提示EBV感染可能參與部分HIV-DLBCL和non-HIV-DLBCL的發(fā)生。但由于本研究中病例樣本量較小，尚未發(fā)現(xiàn)EBV在HIV-DLBCL與non-HIV-DLBCL發(fā)生機(jī)制中有意義的差異性。EBV因其對(duì)人類的普遍易感性、感染的潛伏性以及強(qiáng)烈的致癌性而對(duì)人類健康構(gòu)成巨大威脅，EBV疫苗的使用或抗EBV治療對(duì)預(yù)防和治療淋巴瘤有積極的作用，因此分析淋巴瘤中EBV的感染情況具有重要意義。綜上所述，我們將在后續(xù)研究中擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步深入探討EBV在HIVDLBCL和non-HIV-DLBCL發(fā)病機(jī)制中的作用。

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Analysis on Epstein-Barr Virus Infection in AIDS-related Diffuse Large B-cell Lymphoma

Gao Bo1,Sun Jingjing2,Duan Yuexun3,Deng Gang1,Yang Qian4,Wang Lin5,Pan Yun1*
（1.College of Clinical Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.The First People's Hospitalof Yunnan Province, Kunming 650100,China;3.Infectious Diseases Hospitalof Yunnan Province,Kunming 650301,China;4.The First People's Hospital of Kunming,Kunming 650000,China;5.Infectious Diseases Hospitalof Kunming,Kunming 650200,China）

Objective:To analyze the Epstein-Barr Virus（EBV）infection and discuss the role of EBV in AIDS/HIV-related diffuse large B-celllymphoma（HIV-DLBCL）.Methods:20 cases of HIV-DLBCL were collected as experimentgroup.5 cases ofnon-HIVDLBCL,4 cases of HIV-reactive hyperplasia（HIV-RH）and 5 cases ofnon-HIV-RH were collected as control group.The expression of EBER（EBV-encoded RNA）was detected by in-situ nucleic acid hybridization.Results:The total positive expression rate of EBER in HIV-DLBCL and in non-HIV-DLBCL was 30%（6/20）and 40%（2/5）,respectively.EBER was negative in both HIV-RH and non-HIV-RH.Conclusion:EBV infection was involved in tumorigenesis of part of DLBCLs,butitneeds to be further studied on whether EBV functions differently in HIV-DLBCL and non-HIV-DLBCL or not.

AIDS/HIV-related diffuse large B-celllymphoma;Epstein-Barr Virus;EBER

R733.4

A

2096-2266（2017）04-0059-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.016

（責(zé)任編輯 董 杰）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81660037）；云南省高校病理學(xué)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃支持項(xiàng)目（云教科〔2014〕22號(hào)）；云南省臨床重點(diǎn)專科建設(shè)基金資助項(xiàng)目（云財(cái)社〔2012〕311號(hào)）

2016-05-25

高波，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事分子病理學(xué)研究.

*通信作者：潘云，教授．