金鵬飛　何笑榮　吳學(xué)軍

[摘要] 目的 建立新霉素氯己定軟膏的質(zhì)量控制方法。 方法 分別采用溴化十六烷基三甲胺（HTAB）-溴試液顯色法和乙酰丙酮-對二甲氨基苯甲醛試液顯色法對新霉素氯己定軟膏中的醋酸氯己定和硫酸新霉素進(jìn)行鑒別；采用紫外-可見分光光度法（UV）在254 nm處測定，對新霉素氯己定軟膏中的醋酸氯己定進(jìn)行測定；采用旋光法對新霉素氯己定軟膏中的硫酸新霉素進(jìn)行測定。 結(jié)果 鑒別和含量測定方法均有良好的專屬性。醋酸氯己定的含量測定中，線性范圍為5.02～15.06 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)（r）為1.0000，精密度、重復(fù)性和12 h穩(wěn)定性的RSD分別為0.03%、0.73%和0.11%，百分回收率在100.5%和101.1%之間；硫酸新霉素的含量測定中，線性范圍為0.50～8.00 mg/L，r=0.9999，精密度和重復(fù)性的RSD分別為0.61%和0.44%，溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定，百分回收率在99.67%和100.7%之間。 結(jié)論 該方法可用于新霉素氯己定軟膏的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 新霉素氯己定軟膏；醋酸氯己定；硫酸新霉素；紫外分光光度法；旋光法；鑒別；含量測定

[中圖分類號] R927.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（c）-0153-04

[Abstract] Objective To establish a quality control method for Neomycin and Chlorhexidine Ointment. Methods Chlorhexidine Acetate in Neomycin and Chlorhexidine Ointment was indentified by colorimetric method with HTAB-Br test solution as indicator， while Neomycin Sulfate was indentified by colorimetric method with acetylacetone-p-dimethylaminobenzaldehyde test solution as indicator； Chlorhexidine Acetate in Neomycin and Chlorhexidine Ointment was determined by ultraviolet spectrophotometry （UV） at 254 nm， while Neomycin Sulfate was determined by polarmetric analysis. Results The identification and determination methods showed good specificity. For the determination of Chlorhexidine Acetate， the correlation coefficient （r） was 1.0000 in the range of 5.02-15.06 mg/L， the RSD for precision， repeatability， and 12 h stability were 0.03%， 0.73% and 0.11%， respectively， and the spiked recoveries ranged from 100.5% to 101.1%. For the determination of Neomycin Sulfate， r=0.9999 in the range of 0.50-8.00 mg/L， the RSD for precision and repeatability were 0.61% and 0.44%， respectively， the solutions were stable in 4 h， and the spiked recoveries ranged from 99.67% to 100.7%. Conclusion This method can be used as the quality control method for Neomycin and Chlorhexidine Ointment.

[Key words] Neomycin and Chlorhexidine Ointment； Chlorhexidine Acetate； Neomycin Sulfate； Ultraviolet spectrophotometry； Polarmetric analysi； Identification； Determination

新霉素氯己定軟膏為北京醫(yī)院（以下簡稱“我院”）的特色制劑，處方由硫酸新霉素、醋酸氯己定、冰片等組成，具有殺菌、消炎等作用，臨床上主要應(yīng)用于局部外傷感染，小面積Ⅰ、Ⅱ度燒燙傷，以及膿包瘡等化膿性皮膚病。新霉素氯己定軟膏在我院已有數(shù)十年的應(yīng)用歷史，療效確切，但現(xiàn)有檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)并未規(guī)定醋酸氯己定和硫酸新霉素的含量測定，不利于該制劑的質(zhì)量控制。目前，文獻(xiàn)對于藥品和制劑中醋酸氯己定的測定方法主要有高效液相色譜法[1-9]和紫外分光光度法[10-11]，對于硫酸新霉素的測定方法主要有高效液相色譜法[12-13]、效價(jià)測定法[14]、復(fù)合物比色法[15-16]、紫外分光光度法[17]和旋光法[18]，但新霉素氯己定軟膏中這兩種成分的測定還未見報(bào)道。根據(jù)北京市食品藥品監(jiān)督管理局下發(fā)的《北京市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑再注冊和標(biāo)準(zhǔn)整頓工作》要求，我院對新霉素氯己定軟膏的鑒別和含量測定等質(zhì)量控制方法進(jìn)行了研究，建立的方法簡便易行，現(xiàn)予以報(bào)道。

1 儀器與試藥

Agilent 8453紫外分光光度計(jì)；WZZ-2S自動(dòng)旋光儀；Mettler XP-205電子天平；BECKMAN CS-6KR離心機(jī)；Millipore超純水處理系統(tǒng)。醋酸氯己定對照品（批號：100183-201003）純度為96.2%，硫酸新霉素對照品（批號：130309-201512）效價(jià)為652 U/mg，均購自中國食品藥品檢定研究院；制劑生產(chǎn)用硫酸新霉素原料藥（批號：201308017，國藥準(zhǔn)字H42022149）效價(jià)為654 U/mg，購自宜昌三峽制藥有限公司。氯仿為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。新霉素氯己定軟膏由我院自制，批號：20110127、20110527、20110707。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備工藝

2.1.1 處方 硫酸新霉素10 g，醋酸氯己定2 g，冰片10 g，無水羊毛脂100 g，黃凡士林878 g。

2.1.2 制法 按處方比例，取無水羊毛脂與黃凡士林置適宜的容器中加熱融化（溫度不宜超過60℃）；將冰片、醋酸氯己定和硫酸新霉素依次在潔凈的乳缽中研細(xì)，混合后加入適量上述融化的基質(zhì)，研磨至糊狀，再將剩余的基質(zhì)加入，研勻，分裝，即得。

2.2 鑒別

2.2.1 醋酸氯己定 取本品約2 g，加乙醇20 mL，置水浴中加熱使基質(zhì)溶解，攪拌2 min后，放冷至室溫，濾過，取續(xù)濾液5 mL，加熱的1%溴化十六烷基三甲胺溶液5 mL，再加溴試液與氫氧化鈉試液各1 mL，即顯橙黃色。

2.2.2 硫酸新霉素 取本品2 g，加乙醚20 mL，振搖使基質(zhì)溶解，加水2 mL，振搖提取硫酸新霉素，分取水層，加鹽酸溶液（9→100）2 mL，在水浴中加熱10 min，加8%氫氧化鈉溶液2 mL與2%乙酰丙酮水溶液1 mL，置水浴中加熱5 min，冷卻后，加對二甲氨基苯甲醛試液1 mL，即顯櫻桃紅色。

2.2.3 鑒別方法的專屬性 按照“2.1.2”項(xiàng)下規(guī)定分別制備缺醋酸新霉素的軟膏和缺醋酸氯己定的軟膏，分別用“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行鑒別，結(jié)果均呈陰性反應(yīng)；而各批新霉素氯己定軟膏樣品用“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行鑒別，均呈陽性反應(yīng)，表明本研究制定的鑒別方法具有專屬性。

2.4 醋酸氯己定含量測定

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取醋酸氯己定對照品25.1012 mg于100 mL容量瓶中，加水適量溶解并定容至刻度，搖勻，即為醋酸氯己定儲備液。再精密量取儲備液2、3、4、5、6 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，獲得濃度分別為5.02、7.53、10.04、12.55、15.06 mg/L的對照品溶液。10.04 mg/L的對照品溶液作為外標(biāo)法定量用的對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 取本品約40 g于燒杯中，加熱至軟膏基質(zhì)完全融化，搖勻，趁熱精密稱取融化軟膏樣品約0.5 g于100 mL量瓶中，加熱水60 mL，置于70℃水浴中，時(shí)時(shí)振搖，軟膏基質(zhì)完全融化5 min后取出量瓶，冷卻，用水定容至刻度，搖勻，取適量于離心管中，3000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.4.3 空白溶液的制備 取“2.2.3”項(xiàng)下缺醋酸氯己定的軟膏約40 g，按照“2.4.2”項(xiàng)下要求制備空白溶液。

2.4.4 測定方法 分別取對照品溶液和供試品溶液于1 cm石英吸收池中，以水為空白，在254 nm處測定吸光度，外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.4.5 專屬性 對照品溶液、供試品溶液和空白溶液的紫外譜圖顯示，空白溶液在254 nm處無吸收，表明軟膏中其他成分不干擾醋酸氯己定的測定。見圖1。

2.4.6 線性考察 對“2.4.1”項(xiàng)下不同濃度的對照品溶液分別進(jìn)樣，以紫外吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.044 63X-0.014 16，線性相關(guān)系數(shù)（r）為1.0000，表明在5.02～15.06 mg/L的濃度范圍內(nèi)方法線性良好。

2.4.7 精密度試驗(yàn) 對批號為20110127的一份供試品溶液連續(xù)測定6次，計(jì)算得到254 nm處吸光度的RSD（n=6）為0.03%，表明方法精密度良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對批號為20110127的一份供試品溶液分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)行測定，計(jì)算得到254 nm處吸光度的RSD（n=6）為0.11%，表明12 h內(nèi)方法穩(wěn)定性良好。

2.4.9 重復(fù)性試驗(yàn) 對批號20110127的制劑制備6份供試品溶液，分別測定，計(jì)算得到醋酸氯己定標(biāo)示量百分含量的RSD（n=6）為0.73%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.10 回收率試驗(yàn) 在100 mL容量瓶中加入“2.2.3”項(xiàng)下缺醋酸氯己定的軟膏約0.5 g，再分別加入儲備液3、4、5 mL，按照“2.4.2”項(xiàng)下的規(guī)定，從“加熱水約60 mL……”開始操作，制備溶液。每個(gè)濃度制備3份，共9份樣品，在254 nm處分別測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的醋酸氯己定加標(biāo)量和實(shí)際加入醋酸氯己定量的比值作為回收率。測得低、中、高濃度下的百分回收率分別為100.8%、100.5%和101.1%，RSD（n=3）分別為0.61%、0.60%和0.25%，表明本方法回收率良好。見表1。

2.5 硫酸新霉素含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取硫酸新霉素對照品249.9979 mg于25 mL的量瓶中，加水適量溶解并定容至刻度，搖勻，即為硫酸新霉素儲備液。精密量取儲備液0.5、1、2、4、8 mL于10 mL量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，獲得濃度分別為0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/mL的對照品溶液。2.00 mg/mL的對照品溶液作為外標(biāo)法定量用的對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品約5.0 g于錐形瓶中，加氯仿10 mL，振搖使基質(zhì)分散，加水10 mL振搖后轉(zhuǎn)移至100 mL分液漏斗中，強(qiáng)力振搖后，靜置分層，分取水層置25 mL量瓶中，同法用水提取2次，每次5 mL，合并水層，用水定容至刻度，搖勻，取適量于離心管中，3000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.5.3 空白溶液的制備 取“2.2.3”項(xiàng)下缺硫酸新霉素的軟膏約5.0 g，按照“2.5.2”項(xiàng)下要求制備空白溶液。

2.5.4 測定方法 取對照品溶液和供試品溶液分別測定旋光度，外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.5.5 專屬性 用旋光法對空白溶液進(jìn)行測定，旋光度為0，表明樣品中其他成分和輔料不干擾硫酸新霉素的測定。

2.5.6 線性考察 對“2.5.1”項(xiàng)下不同濃度的對照品溶液分別進(jìn)樣，以旋光度（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.0507X+0.0021，線性相關(guān)系數(shù)（r）為0.9999，表明在0.50～8.00 mg/mL的范圍內(nèi)方法線性良好。

2.5.7 精密度試驗(yàn) 對批號為20110127的一份供試品溶液連續(xù)測定6次，計(jì)算得到旋光度的RSD（n=6）為0.61%，表明方法精密度良好。

2.5.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對批號為20110127的一份供試品溶液分別于0、0.5、1、1.5、2、4 h進(jìn)行測定，計(jì)算得到旋光度的RSD（n=6）為1.79%，說明4 h內(nèi)方法穩(wěn)定性良好。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液放置超過6 h后，旋光度顯著增加，因而供試品溶液制備后應(yīng)在4 h內(nèi)測定。

2.5.9 重復(fù)性試驗(yàn) 對批號20110127的制劑制備6份供試品溶液，分別測定，計(jì)算得到硫酸新霉素標(biāo)示量百分含量的RSD（n=6）為0.44%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.10 回收率試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下缺硫酸新霉素的軟膏約5.0 g，共9份，分別加入硫酸新霉素對照品25、50、100 mg，每個(gè)濃度制備3份，按照“2.5.2”項(xiàng)下規(guī)定制備加標(biāo)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的硫酸新霉素加標(biāo)量和實(shí)際加入硫酸新霉素的量的比值作為回收率。測得低、中、高濃度下的百分回收率分別為99.67%、100.3%和100.7%，RSD（n=3）分別為1.55%、2.33%和1.24%，表明本方法回收率良好。見表2。

2.6 樣品測定

對批號分別為20110127、20110527、20110707的新霉素氯己定軟膏進(jìn)行醋酸氯己定和硫酸新霉素的含量測定。每批樣品測定2份，取平均值作為含量。測得醋酸氯己定的標(biāo)示量百分含量分別為98.13%、99.02%和100.3%；硫酸新霉素的標(biāo)示量百分含量分別為98.88%、106.2%和99.57%。

3 討論

3.1 鑒別方法的確定

本方法中醋酸氯己定的鑒別參照了《中國藥典》項(xiàng)下醋酸氯己定軟膏的鑒別方法[19]1543，硫酸新霉素的鑒別參照了《中國藥典》項(xiàng)下硫酸新霉素原料藥的鑒別方法[19]1363-1364，只是由于基質(zhì)不同，前處理方法略有不同。

3.2 醋酸氯己定含量測定方法的確定

新霉素氯己定軟膏中除了硫酸新霉素和醋酸氯己定能溶于水外，其他成分均不溶于水，用水進(jìn)行提取可有效去除其他成分的干擾。而同為水溶性的硫酸新霉素在254 nm處無吸收，因而也不干擾測定。水浴加熱使軟膏基質(zhì)完全融化，可使醋酸氯己定完全溶出，冷卻后油性基質(zhì)吸附在容器內(nèi)壁，不影響定容。此外，研究還發(fā)現(xiàn)用濾紙或尼龍濾膜過濾時(shí)，醋酸氯己定均會被大量吸附，導(dǎo)致方法回收率和含量偏低，最終確定使用3000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行分析?！吨袊幍洹反姿崧燃憾ㄜ浉嗟暮繙y定也用紫外-可見分光光度法[1]，但需要用到多種溶劑并進(jìn)行液液萃取，而新霉素氯己定軟膏的基質(zhì)比醋酸氯己定軟膏更為復(fù)雜，但本文建立的紫外-可見分光光度法較《中國藥典》方法更為簡單。

3.3 硫酸新霉素含量測定方法的確定

新霉素氯己定軟膏中硫酸新霉素提取過程中，利用硫酸新霉素易溶于水的特性，用水提取硫酸新霉素，結(jié)果由于基質(zhì)中無水羊毛脂的干擾，樣品回收率僅能達(dá)到85%。分析可能是基質(zhì)包裹造成回收率偏低。在提取過程加入少量氯仿溶液可促使軟膏基質(zhì)充分溶散，提高方法的回收率。同時(shí)發(fā)現(xiàn)濾紙或尼龍濾膜過濾也會少量吸附硫酸新霉素，導(dǎo)致含量降低，因而采用3000 r/min離心10 min的方法制備溶液。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 夏方亮.HPLC法測定復(fù)方醋酸氯己定漱口水中醋酸氯己定和甲硝唑的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2015，31（3）：252-253.

[2] 夏方亮.HPLC測定醋酸氯己定碘醇溶液中醋酸氯己定的含量[J].食品與藥品，2014，16（5）：355-357.

[3] 張莉莉，劉光斌，張玉葉.HPLC法測定復(fù)方氯己定凝膠中醋酸氯己定和鹽酸達(dá)克羅寧含量[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29（14）：2108-2109.

[4] 王璐.高效液相色譜法測定復(fù)方替硝唑氯己定含漱液中醋酸氯己定含量[J].中國藥業(yè)，2012，21（15）：53-54.

[5] 田鵬程，孫蘭莉，黃國軍.HPLC法測定甲硝唑氯己定洗劑中氯己定含量[J].中國藥師，2009，12（2）：257-258.

[6] 李小榮.高效液相色譜法測定醋酸氯己定緩釋凝膠中醋酸氯己定的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（19）：1727-1728.

[7] 賈立華，付桂英，潘強(qiáng)，等.HPLC法測定復(fù)方醋酸氯己定洗劑中醋酸氯己定和克霉唑含量[J].中國藥師，2004， 7（1）：28-29.

[8] 王璐，史紅蕾，李清.HPLC法測定鹽酸氯己定痱子粉中鹽酸氯己定的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2004，19（4）：152-154.

[9] 付華峰，關(guān)繼禹，曲志爽，等.中空纖維膜液相微萃取-高效液相色譜法測定醋酸氯己定痔瘡栓中的醋酸氯己定[J].色譜，2006，24（6）：566-569.

[10] 孫成宏，李云霞.紫外分光光度法測定復(fù)方醋酸氯己定涂膜劑中醋酸氯己定的含量[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2013， 25（8）：91-93.

[11] 汪承松，談晚生，徐再英，等.復(fù)方氯己定溶液中氯己定和丁卡因的含量測定[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2004，23（3）：187-188.

[12] 張玉嬋，廖志強(qiáng)，郭環(huán)娟.HPLC-ELSD法測定曲安奈德新霉素貼膏中新霉素含量[J].今日藥學(xué)，2015，25（4）：268-270.

[13] 陳蓉，付麗娟.HPLC法柱前衍生法測定復(fù)方新霉素滴耳液中新霉素的含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2004，5（3）：48-50.

[14] 盧翔，程櫻.新霉素氟輕松乳膏中新霉素效價(jià)測定方法探討[J].中國藥師，2015，10（7）：670-671.

[15] 何梅鳳，吳偉，王延?xùn)|，等.快速比色法測定硫酸新霉素滴眼劑的含量[J].藥品評價(jià)，2006，3（3）：202-203.

[16] 湛海粼.曲利本藍(lán)分光光度法測定新霉素的含量[J].重慶教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，16（6）：50-52.

[17] 陳沛琦，錢麗華，高誠.紫外分光光度法測定硫酸新霉素滴眼液的含量[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2005，13（4）：59-60.

[18] 盧芳，劉群，余祥華，等.旋光法測定硫酸新霉素含量[J].中國獸藥雜志，2006，40（6）：31-32.

[19] 國家藥典委員會.中國藥典[M].二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

（收稿日期：2016-09-12 本文編輯：王紅雙）