祁紅學(xué) 劉秀萍 安靜

摘要[目的] 優(yōu)化魚(yú)體肌肉組織中脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）含量的測(cè)定條件。[方法] 使用硫代巴比妥酸分光光度法測(cè)定LPO含量，設(shè)計(jì)乙酸用量、十二烷基磺酸鈉（SDS）用量、處理時(shí)間和溫度4因素3水平的正交試驗(yàn)，考察各因素水平組合對(duì)魚(yú)體肌肉中LPO含量測(cè)定的影響，優(yōu)化測(cè)定條件。[結(jié)果]各因素對(duì)LPO含量測(cè)定結(jié)果的影響由大到小依次為SDS用量、乙酸用量、溫度、處理時(shí)間；通過(guò)直觀分析和方差分析，得出最優(yōu)組合為A3B1C3D2 ，即測(cè)定的最優(yōu)組合為20%的乙酸，65 ℃水浴中保持60 min。[結(jié)論]該研究可為魚(yú)類(lèi)氧化應(yīng)激損傷研究提供方法支持。

關(guān)鍵詞脂質(zhì)過(guò)氧化；分光光度法；正交試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）10-0091-02

Improvement of Thiobarbituric Acid Reaction for the Dertermination of Lipid Peroxidation in the Muscles of Fish

QI Hongxue，LIU Xiuping，AN Jing*（College of Chemistry and Chemical Engineering，Jinzhong University，Jinzhong，Shanxi 030619）

Abstract[Objective] To improve the optimum condition for measuring the lipid peroxidation （LPO） in the muscles of fish.[Method] The LPO was determined using spectrophotometer with thiobarbituric acid.The orthogonal design with four factors and three levels was conducted to evaluate the level of LPO in the cyprinoid fish.Four factors were included the gradient of acetic acid，sodium dodecyl sulfate，time and temperature，respectively.[Result] The weight sequence was known as SDS，the gradient of acetic acid，temperature，time by comparing the difference of each factor.The results indicated that the optimum group was A3B1C3D2 by visual analysis and variance analys，namely 20% acetic acid，65 ℃ water bath，60 min.[Conclusion] The study can support the research on the demage of oxidative stress in fish.

Key wordsLipid peroxidation；Spectrophotometry；Orthogonal test

細(xì)胞在發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，該反應(yīng)是發(fā)生于不飽和脂肪酸（UFA）共價(jià)鍵上的一系列自由基反應(yīng)。機(jī)體內(nèi)由于有很多UFA，因此極易受到氧化作用損傷，產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）[1]。

目前，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的研究領(lǐng)域涵蓋了腫瘤、感染、衰老、心血管疾病、毒理學(xué)等方面[2-3]。測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化的方法有熒光和分光光度法[4]，由于分光光度法操作簡(jiǎn)單、快速，仍在大量使用，其中硫代巴比妥酸（TBARS）法是最為常用的方法[5]。一些脂肪酸，尤其是不飽和脂肪酸，氧化后逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合物（如醛和酮類(lèi)化合物），稱(chēng)之為T(mén)BARS反應(yīng)物。通過(guò)檢測(cè)TBARS反應(yīng)物的含量來(lái)反映LPO的水平，從而表征氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞膜的損傷水平[6]。有關(guān)此方法優(yōu)化與改進(jìn)的報(bào)道較多[7-8]，但鮮有專(zhuān)門(mén)針對(duì)魚(yú)體肌肉組織測(cè)定方法的報(bào)道，因此，有必要對(duì)其測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化，以便適應(yīng)魚(yú)體肌肉組織中LPO含量的測(cè)定。

筆者在Ohkawa等[5]的方法基礎(chǔ)上，加大三氯乙酸（TCA）的用量[9]，用甲醇代替正丁醇[8]，采用4因素3水平正交試驗(yàn)對(duì)鯉魚(yú)肌肉組織液的LPO水平進(jìn)行測(cè)定，4個(gè)因素分別為乙酸用量、十二烷基硫酸鈉（SDS）用量、處理時(shí)間和溫度。使用V-1200可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)出鯉魚(yú)肌肉酶液的LPO吸光度值，再運(yùn)用直觀分析法和方差分析對(duì)LPO的吸光度值進(jìn)行分析，最終得到鯉魚(yú)肌肉組織中LPO含量的最佳測(cè)定條件。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。硫代巴比妥酸，分析純，北京化工廠；0.9%NaCl溶液，上海金穗生物科技有限公司；乙酸，分析純，北京化工廠；鯉魚(yú)，太原市萬(wàn)柏林區(qū)市場(chǎng)；SDS，分析純，北京紅星化工科技公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備。數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6），常州智博瑞儀器制造有限公司；電子天平（WT3003），上海西艾愛(ài)電子有限公司；水浴氮吹儀（SHD-003），上海極恒實(shí)業(yè)有限公司；電動(dòng)離心機(jī)（YXJ-1），江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)（V-1200），上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2試劑的配制

2%硫代巴比妥酸水溶液：用前加熱到70 ℃左右溶解。

10%和20%乙酸：用鹽酸調(diào)節(jié)pH為3.5。

2.5%和5.0% SDS水溶液：稱(chēng)取2.5和5.0 g 的SDS，分別溶于100 mL 蒸餾水中，混勻后所得溶液就是2.5%和5.0% SDS工作液。

1.3鯉魚(yú)肌肉中LPO含量測(cè)定的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取的4個(gè)因素分別為乙酸用量、SDS用量、處理時(shí)間和溫度。4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

1.4酶液的制備

取出鯉魚(yú)肌肉組織一小塊，用電子天平稱(chēng)重為3.553 g，加0.9% NaCl溶液5 mL，用研缽將肌肉研磨，直至得到鯉魚(yú)肌肉酶液。用移液器將鯉魚(yú)肌肉酶液轉(zhuǎn)移到5 mL試管，以3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，待測(cè)。

1.5LPO含量的測(cè)定

每測(cè)定管加入0.3 mL酶液、0.1 mL SDS、0.3 mL乙酸、0.2 mL 2%硫代巴比妥酸溶液。分別在18、65和95 ℃下反應(yīng)，于20、35和60 min時(shí)取出相應(yīng)測(cè)定管，加入1.0 mL 甲醇，充分混勻后離心，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)535 nm處測(cè)其吸光度值。

2結(jié)果與分析

2.1正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析

鯉魚(yú)肌肉中LPO含量測(cè)定的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)各因素的極差進(jìn)行比較，可知RB>RA>RD>RC，得出各因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響由大到小依次為SDS用量、乙酸用量、溫度、處理時(shí)間?？梢钥闯觯琒DS和乙酸的用量對(duì)LPO含量測(cè)定的影響占主要因素，反應(yīng)溫度和時(shí)間的影響次之。

通過(guò)每個(gè)試驗(yàn)因子的均值可以看出，A3B1C3D2為測(cè)定鯉魚(yú)肌肉組織中LPO含量的最佳方案，即為正交試驗(yàn)中的7號(hào)處理組合，也是9個(gè)處理組合中吸光度值最高者，但與其他處理有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，還需進(jìn)行方差分析。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)A=10.9，F(xiàn)B=23.3，F(xiàn)C=1.0，F(xiàn)D=5.6，F(xiàn)0.05=19.0，F(xiàn)0.01=99.0?？梢钥闯觯挥幸蛩谺的F值達(dá)到顯著水平（P<0.05），即SDS的用量對(duì)LPO含量的影響最為顯著，其他因素的影響均不顯著。這與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法有所不同，主要區(qū)別在于SDS的含量，文獻(xiàn)報(bào)道可加入5.0%的SDS，以除去蛋白質(zhì)的干擾，而此次正交試驗(yàn)的結(jié)果顯示，其對(duì)LPO含量的測(cè)定具有一定的干擾，SDS在不加入時(shí)效果最為明顯，在加入2.5%和5.0%時(shí)達(dá)不到最佳測(cè)定條件，作用不但不明顯，反而具有干擾作用，因此以不用為宜。

3結(jié)論

近年來(lái)，藥物中間體、殺蟲(chóng)劑等環(huán)境污染物逐漸威脅水生生物安全，研究水體生物的氧化應(yīng)激，可評(píng)價(jià)污染物的毒性，為疾病的早期診斷、預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。該研究通過(guò)設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)，確定了魚(yú)體肌肉中LPO含量測(cè)定的最佳條件為20%的乙酸，反應(yīng)時(shí)間60 min，反應(yīng)溫度65 ℃。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定，可較好地測(cè)定魚(yú)體肌肉組織中LPO含量，為魚(yú)類(lèi)氧化應(yīng)激評(píng)定提供了依據(jù)，有望用于毒性物質(zhì)或未知物對(duì)魚(yú)類(lèi)造成的氧化應(yīng)激損傷機(jī)理的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]

SIES H.Biochemistry of oxidative stress[J].Angewandte chemie international edition in English，1986，25（12）：1058-1071.

[2] DEL RIO D，STEWART A J，PELLEGRINI N.A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress[J].Nutrition metabolism and cardiovascular diseases，2005，15（4）：316-328.

[3] 張秋萍，吳霞紅，鄭劍恒，等.生物樣本中丙二醛測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J].理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊(cè)），2016，52（8）：979-985.

[4] 王濤，汪江淮，陳惠孫.生物組織中LPO的熒光測(cè)定[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，11（1）：77-78.

[5] OHKAWA H，OHISHI N，YAGI K.Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction[J].Analytical biochemistry，1979，95（2）：351-358.

[6] DIX T A，AIKENS J.Mechanisms and biological relevance of lipid peroxidation initiation[J].Chemical research in toxicology，1993，6（1）：2-18.

[7] 吳旭增，劉世杰，江泉觀，等.用硫代巴比妥酸法測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化物的條件探討[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1983（6）：19.

[8] 張秀明，嚴(yán)麗娟，柴建開(kāi)，等.改良硫代巴比妥酸熒光法測(cè)定血清過(guò)氧化脂質(zhì)[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1996，23（2）：175-179.

[9] 楊李，唐瑛，左娟，等.硫代巴比妥酸法測(cè)定血清脂質(zhì)過(guò)氧化物方法的改進(jìn)[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2004，18（1）：30-32.