謝偉玲　柴勝豐　蔣運(yùn)生　唐健民　陳宗游　鄒蓉　韋霄

摘要： 該研究采用ISSR分子標(biāo)記，對黃枝油杉7個(gè)自然種群的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：用12條ISSR引物對218個(gè)黃枝油杉個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出125個(gè)位點(diǎn)。在物種水平上，多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)（PPL）為100.00%，Shannon信息多樣性指數(shù)（I）為0.417 7，Neis基因多樣性指數(shù)（H）為0.266 6；在種群水平上，多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)（PPL）在71.20%～92.00%之間，平均值為80.69%，Shannon信息多樣性指數(shù)（I）在0.327 3～0.388 6之間，平均值為0.354 8，Neis基因多樣性指數(shù)（H）在0.213 9～0.247 8之間，平均值為0.229 1。這說明黃枝油杉在物種水平和種群水平上均顯示出較高的遺傳多樣性。Neis遺傳多樣性分析（Gst=0.143 3）和AMOVA分析（Φst=17.91%）表明，黃枝油杉的遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，種群間的遺傳分化程度較低，種群間保持一定的基因交流（Nm=2.989 0>1）。Mantel分析顯示，黃枝油杉種群間的遺傳距離和地理距離之間不存在顯著的相關(guān)關(guān)系（r=0.456 7， P=0.061 0>0.05）。

關(guān)鍵詞： 黃枝油杉， ISSR分子標(biāo)記， 遺傳多樣性， 遺傳結(jié)構(gòu)， 保護(hù)策略

中圖分類號： Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 10003142（2017）01003606

Abstract： ISSR markers were used to investigate the genetic diversity of seven natural populations of Keteleeria calcarea. Twelve ISSR primers produced 125 loci. At the species level， the percentage of polymorphic loci （PPL） was 100.00%， Shannons Information index （I） was 0.417 7 and Neis gene diversity index （H） was 0.266 6. At the population level， the percentage of polymorphic loci was 71.20%-92.00% and the average value was 80.69%， Shannons Information index （I） was 0.327 3-0.388 6 with the average value 0.3548 and Neis gene diversity index （H） was 0.213 9-0.247 8 with the average value 0.229 1. K. calcarea in both species and population levels showed higher genetic diversity. Neis genetic diversity analysis （Gst=0.143 3） and AMOVA analysis （Φst=17.91%） showed that the genetic variation of K. calcarea mainly occurred within populations， and the genetic differentiation among populations was low. The gene flow （Nm） between populations was high （2.989 0）. Mantel analysis showed that the genetic distance of K. calcarea natural populations had no significant correlation with their geographic distance （r=0.456 7， P=0.061 0>0.05）.

Key words： Keteleeria calcarea， ISSR markers， genetic diversity， genetic structure， conservation strategy

黃枝油杉（Keteleeria calcarea）是一種松科（Pinaceae）油杉屬（Keteleeria）的喜陽、常綠大喬木（何平，2005），為我國特有的珍稀瀕危樹種，同時(shí)是第三紀(jì)古老原始的樹種，主要分布于我國貴州、湖南、廣西一帶（李樹剛和梁疇芬，1990；沈燕等，2009；覃海寧，2010），例如平塘、獨(dú)山、江永、融安、桂林等地，生于海拔560～1 100 m的石灰?guī)r山坡。由于根系發(fā)達(dá)，并具有發(fā)達(dá)的皮層，因而具有很強(qiáng)的穿插力和貯藏較多水分，故能耐石山干旱生境，可用于石山綠化（彭少麟，2003）；其材質(zhì)堅(jiān)固、木材紋理直、樹干通直、耐水浸，可用于造船、建筑、家具等（蔣柏生等，2008）。此外，由于其樹形優(yōu)美，枝繁葉茂、雄偉挺拔，可用作觀賞樹種（傅立國，1989）。20世紀(jì)70年代以來，黃枝油杉天然種群遭受嚴(yán)重破壞，野外種群數(shù)量銳減，分布區(qū)域狹窄，且母樹開花結(jié)實(shí)少，種子發(fā)育不良，天然更新能力較弱，已處于瀕危狀態(tài)。目前關(guān)于黃枝油杉的研究報(bào)道很少，大多集中在無性繁育技術(shù)（蔣柏生等，2008）、資源分布現(xiàn)狀（沈燕等，2009）、化學(xué)成分分析（何道航等，2006）、種群生態(tài)學(xué)（符支宏，2014）等方面。關(guān)于黃枝油杉遺傳多樣性的研究，至今尚未見有報(bào)道。

ISSR是基于PCR 技術(shù)、以簡單重復(fù)序列為引物的一種分子標(biāo)記技術(shù)，由Zietkiewicz et al（1994）提出，具有多態(tài)性水平高、產(chǎn)物特異性強(qiáng)、DNA用量少以及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于構(gòu)建遺傳圖譜（范付華等，2010；張林等，2012）、種質(zhì)資源鑒定（宋吉軒，2010；鄭鷺，2007）、品種親緣關(guān)系及分類研究（范付華等，2010；梁景霞等，2008）、分析遺傳多樣性（鄭鷺，2007；梁景霞等，2008）等方面。本文擬采用ISSR分子標(biāo)記對黃枝油杉進(jìn)行遺傳多樣性分析，揭示其種群遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)，分析遺傳多樣性水平與瀕危原因的關(guān)系，并為黃枝油杉的資源保護(hù)制定科學(xué)合理的保護(hù)策略。

1材料與方法

1.1 材料

2014年9-12月，分別在桂林臨桂縣二塘沉橋村（LG）、桂林恭城縣三江三寨村（GC）、賀州富川縣麥嶺鎮(zhèn)櫟尾村（FC）、柳州融安縣都木村（RA）、河池南丹縣里湖鄉(xiāng)懷里村（ND）、貴州平塘縣者密鎮(zhèn)（PT）、貴州獨(dú)山縣堯棒鄉(xiāng)（DS）等黃枝油杉分布地采集7個(gè)種群生長良好的、健康的黃枝油杉葉片。每個(gè)種群各取27～33個(gè)個(gè)體，新鮮葉片迅速裝入封口袋，分別用硅膠迅速干燥固定，帶回試驗(yàn)室分析。廣西植物研究所蔣運(yùn)生研究員對所采集的樣品進(jìn)行了鑒定，確定是黃枝油杉（Keteleeria calcarea）。各采樣地點(diǎn)的自然概況如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 黃枝油杉總DNA的提取采用CTAB法提取黃枝油杉的總DNA，但在水浴前用-20 ℃預(yù)冷的丙酮洗兩次（代文娟，2006）。用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA的質(zhì)量和完整性，DNA的純度和濃度用NanoDrop 2000c 超微量分光光度計(jì)檢測，存儲(chǔ)在-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 ISSR的擴(kuò)增與檢測從100條ISSR引物中篩選出了12條擴(kuò)增效果好、重復(fù)性好、具有多態(tài)性的引物（表2）對黃枝油杉7個(gè)自然種群共218個(gè)個(gè)體進(jìn)行ISSR分析。采用25 μL體系，其中含有2.5 μL的10×PCR buffer、1.5 U的 Taq DNA聚合酶、1.0 μmol·L1的引物、2.0 mmol·L1 的Mg2+、0.10 mmol·L1 的dNTP、以及30 ng的模板DNA，剩余用滅菌的ddH2O補(bǔ)夠25 μL；擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53～58 ℃（不同的引物，其退火溫度不同，具體見表2）退火45 s，72 ℃延伸90 s，以上3個(gè)步驟循環(huán)50次；最后72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳1～1.5 h，溴化乙錠（0.5 μg·mL1）染色20 min，用UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.3 數(shù)據(jù)整理及分析對種群遺傳參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析要在兩個(gè)假設(shè)下才能進(jìn)行，即（1）種群處于HardyWeinberg平衡；（2）電泳遷移率相同的條帶是擴(kuò)增基因組上相同DNA片段的產(chǎn)物。ISSR為顯性標(biāo)記，根據(jù)電泳圖譜中擴(kuò)增產(chǎn)物的有無及其分子量大小，將電泳圖譜中同一遷移位置上有清晰條帶（包括弱帶）的記為“1”，沒有條帶的記為“0”。應(yīng)用POPGENE1.31軟件計(jì)算Neis基因多樣性指數(shù)（H）、多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)（PPL）、觀察到的等位基因數(shù)（Na）、Shannon信息多樣性指數(shù)（I）、有效等位基因數(shù)（Ne），基因分化系數(shù)（Gst）、種群內(nèi)的基因多樣性（Hs）、種群總的基因多樣性（Ht）及 Neis遺傳距離（D），基因流（Nm）等。用win AMOVA 1.55軟件分析種群間和種群內(nèi)的遺傳變異。根據(jù)Neis遺傳距離（D）應(yīng)用NTSYSpc 2.02軟件對7個(gè)黃枝油杉種群進(jìn)行聚類分析。進(jìn)一步用TFPGA軟件進(jìn)行Mantel test分析，檢測7個(gè)黃枝油杉種群的遺傳距離和地理距離之間的關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1 黃枝油杉的遺傳多樣性

用12條ISSR引物對218個(gè)黃枝油杉個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出125個(gè)位點(diǎn)。由表3可知，在物種水平上，Shannon 信息多樣性指數(shù)（I）為0.417 7，多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)（PPL）為100.00%，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.427 2，Neis基因多樣性指數(shù)（H）為0.266 6。

在種群水平上，7個(gè)種群的多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)（PPL）在71.20%～92.00%之間，平均值為80.69%；Shannon 信息多樣性指數(shù)（I）在0.327 3～0.388 6之間，平均值為0.354 8，Neis基因多樣性指數(shù)（H）在0.213 9～0.247 8之間，平均值為0.229 1。其中遺傳多樣性最高的是柳州融安都木村（RA）種群（H=0.247 8， I=0.388 6， PPL=92.00%），其次是賀州富川櫟尾村（FC）種群（H=0.246 5， I=0.380 5， PPL=84.80%），最低的是貴州獨(dú)山堯棒鄉(xiāng)（DS）種群（H=

0.213 9， I=0.327 3， PPL=71.20%）。

2.2 黃枝油杉種群的遺傳結(jié)構(gòu)

基因分化系數(shù)（Gst）由種群總的基因多樣性（Ht）和種群內(nèi)的基因多樣性（Hs）計(jì)算得出。黃枝油杉種群總的基因多樣性（Ht）為0.267 4，種群內(nèi)的基因多樣性（Hs）為0.229 1， 基因分化系數(shù) （Gst）為0.143 3，由此可知，黃枝油杉總的遺傳變異中發(fā)生在種群之間的遺傳變異只有14.33%，其余的85.67%發(fā)生于種群內(nèi)。進(jìn)一步對黃枝油杉的7個(gè)種群的遺傳變異進(jìn)行AMOVA分析，種群間遺傳分化系數(shù)Φst=17.91%，表明在總的遺傳變異中，有17.91%的遺傳變異是發(fā)生在種群之間的，82.09%的遺傳變異是發(fā)生在種群內(nèi)的（表4），說明黃枝油杉的遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，種群間的遺傳分化較小?；蛄鱊m =2.989 0>1，表明黃枝油杉種群之間保持一定的基因交流，不容易出現(xiàn)遺傳分化的現(xiàn)象。

2.3 黃枝油杉種群的聚類分析

根據(jù)Neis遺傳距離（表5）用NTSYSpc 2.02軟件對7個(gè)黃枝油杉種群進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果見圖1。由表5可知，河池南丹懷里村種群（ND）和貴州獨(dú)山堯棒鄉(xiāng)種群（DS）的遺傳一致度最大（0.966 9），遺傳距離最?。?.033 6）；賀州富川櫟尾村種群（FC）和貴州獨(dú)山堯棒鄉(xiāng)種群（DS）的遺傳一致度最?。?.916 1），遺傳距離最大（0.087 7）。由圖1的UPGMA聚類圖可知， 貴州獨(dú)山堯棒鄉(xiāng)種群（DS）和河池南丹懷里村種群（ND）先聚為一類，其余的5個(gè)種群聚為一大類，最后全部種群再匯聚成一類，7個(gè)種群并不是按照地理距離進(jìn)行分支。進(jìn)一步用TFPGA軟件進(jìn)行Mantel test分析，結(jié)果表明黃枝油杉種群之間的遺傳距離和地理距離之間無顯著性差異（r=0.456 7， P=0.061 0>0.05）。

3討論

3.1 黃枝油杉遺傳多樣性評價(jià)

一般認(rèn)為，瀕危物種擁有較低的遺傳多樣性水平，但研究發(fā)現(xiàn)，一些瀕危物種的遺傳多樣性水平保持在較高水平（錢迎倩和馬克平，1994；Grant，1991；Soltis PS & Soltis DE，1991）。在物種水平上，黃枝油杉的多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)（PPL）為100.00%， Shannon信息多樣性指數(shù)（I）為0.417 7，Neis基因多樣性指數(shù)（H）為0.266 6，與其他的瀕危裸子植物，如代文娟（2006）研究的資源冷杉（PPL=63.38%，I=0.234 9，H=0.152 7）、袁建國（2005）研究的百山祖冷杉（PPL=42.68%，I=0.242 0，H=0.165 7）及李江偉（2014）研究的臺(tái)灣杉（PPL=78.21%，I=0.377 8，H=0.249 4）等相比，黃枝油杉總的遺傳多樣性顯示出較高的水平，表明黃枝油杉的適應(yīng)環(huán)境的能力較強(qiáng)，進(jìn)化潛力較大（Hogbin & Peakall，1999），其瀕危的原因并不是遺傳多樣性低的內(nèi)部因素造成的；但比劉曉燕（2007）研究的華東黃杉（PPL=90.79%，I=0.497 4，H=0.336 1）及張蕊（2009）研究的南方紅豆杉（PPL=98.89%，I=0.606 3，H=0.419 2）等的遺傳多樣性水平低。

Neis遺傳多樣性和AMOVA分析結(jié)果都揭示了黃枝油杉的遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)。黃枝油杉的基因分化系數(shù)（Gst）為0.143 3，總的遺傳變異中發(fā)生在種群之間的遺傳變異有14.33%，其余的85.67%發(fā)生于種群內(nèi)。AMOVA分析結(jié)果表明在總的遺傳變異中，有17.91%的遺傳變異是發(fā)生于種群之間的，82.09%的遺傳變異是發(fā)生在種群內(nèi)的。基因流Nm =2.989 0>1，表明黃枝油杉種群之間保持一定的基因交流，有效抵制了遺傳漂變的影響，不容易出現(xiàn)遺傳分化的現(xiàn)象。大量研究結(jié)果表明（Loveless & Hamriek，1984），裸子植物的生物學(xué)特性（如風(fēng)媒傳粉、壽命長、頻繁的基因交流等）對其遺傳變異維持高水平和種群間較小的分化很有利，即使其分布范圍很窄，但其種群仍會(huì)擁有整個(gè)物種的大多數(shù)遺傳變異。

根據(jù)Neis遺傳距離對7個(gè)黃枝油杉種群進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示黃枝油杉7個(gè)種群并不是按照地理距離進(jìn)行分支。進(jìn)一步用TFPGA軟件進(jìn)行Mantel test分析，結(jié)果表明黃枝油杉種群之間的遺傳距離和地理距離之間無顯著性差異（r=0.456 7， P=0.061 0>0.05）。

3.2 黃枝油杉保護(hù)建議

瀕危植物是植物遺傳育種的珍貴材料，很多瀕危植物具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和文化價(jià)值。瀕危植物是研究植物起源、進(jìn)化的有力證據(jù)。植物瀕危是內(nèi)部因素和外部環(huán)境共同作用的結(jié)果，內(nèi)部因素包括遺傳力、生殖力、適應(yīng)力等，外部環(huán)境包括自然災(zāi)害、人為因素等。黃枝油杉為我國特有的珍稀瀕危樹種和中亞熱帶珍貴樹種，目前具有較高的遺傳多樣性，說明其瀕危的原因并不是遺傳多樣性低的內(nèi)部因素造成的。建議將遺傳多樣性最高的柳州融安都木村（RA）種群作為重點(diǎn)保護(hù)單元；建議保護(hù)好所有的黃枝油杉自然分布區(qū)生態(tài)環(huán)境，并盡可能保護(hù)種群內(nèi)的所有個(gè)體，防止人類繼續(xù)亂砍濫伐以及破壞其生境和生物群落結(jié)構(gòu)。此外，當(dāng)?shù)氐牧謽I(yè)主管部門應(yīng)加強(qiáng)對黃枝油杉的宣傳保護(hù)教育，讓當(dāng)?shù)厝罕娏私恻S枝油杉的重要意義及價(jià)值，使廣大群眾形成自覺保護(hù)黃枝油杉的意識；有關(guān)執(zhí)法部門應(yīng)該引起高度重視，嚴(yán)厲打擊和查處破壞黃枝油杉的犯罪活動(dòng)，阻止黃枝油杉繼續(xù)遭受破壞。

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