劉仁儀，李一新

一次性大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)淋巴細(xì)胞鈣瞬態(tài)、通道基因表達(dá)和刺激劑誘導(dǎo)細(xì)胞增殖能力的影響

劉仁儀1，李一新2

目的：淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)通常被用作細(xì)胞免疫功能的檢測(cè)指標(biāo)，運(yùn)動(dòng)性免疫抑制是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，然而其機(jī)制至今不甚明了。通過構(gòu)建一次性大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)模型，研究急性運(yùn)動(dòng)對(duì)淋巴細(xì)胞鈣離子瞬態(tài)、鈣通道基因表達(dá)和增殖功能的影響，從而探討運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的分子機(jī)制。方法：相互匹配的雄性小白鼠隨機(jī)被分成控制組和運(yùn)動(dòng)組（分為運(yùn)動(dòng)后即刻處死組和運(yùn)動(dòng)后3 h處死組）；運(yùn)動(dòng)組執(zhí)行80%最大攝氧量強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)至力竭；淋巴細(xì)胞分離自小鼠脾臟；淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度通過熒光穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)分析系統(tǒng)測(cè)量fura-2(AM)負(fù)載細(xì)胞懸液而確定；結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)與羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE）負(fù)載法評(píng)估細(xì)胞增殖反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)淋巴細(xì)胞相關(guān)通道基因表達(dá)。結(jié)果：在運(yùn)動(dòng)后即刻處死組，植物血凝素（PHA）誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化幅度和鈣離子釋放率顯著低于控制組（P＜0.05）；在運(yùn)動(dòng)后3 h處死組，毒胡蘿卜素（TG）誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞鈣離子釋放率顯著低于控制組（P＜0.05），且淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣通道基因RYR核酸表達(dá)水平顯著高于控制組（P＜0.05），但細(xì)胞膜鈣通道基因STIM表達(dá)在兩組之間沒有顯著性差異（P＞0.05），刺激劑體外刺激誘導(dǎo)細(xì)胞增殖水平顯著低于控制組（P＜0.05）。結(jié)論：急性大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可能通過下調(diào)淋巴細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)膜鈣通道基因表達(dá)，抑制胞內(nèi)鈣離子釋放以及胞內(nèi)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，相應(yīng)降低刺激劑誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖能力，即：淋巴細(xì)胞免疫功能削弱。這可能是急性運(yùn)動(dòng)引起機(jī)體免疫抑制的一個(gè)重要分子機(jī)制。

大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)；鈣離子；通道；淋巴細(xì)胞

1 前言

運(yùn)動(dòng)是一種復(fù)雜的、獨(dú)特的、可控的、可量化的和可重復(fù)進(jìn)行的應(yīng)激刺激［11］。它可致機(jī)體功能明顯改變，也是影響機(jī)體免疫功能的一個(gè)關(guān)鍵因子，它與許多臨床的生理應(yīng)激刺激引起免疫反應(yīng)模式類似［11］。機(jī)體免疫功能增強(qiáng)或減弱取決于身體活動(dòng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。一般認(rèn)為，適宜的運(yùn)動(dòng)刺激免疫機(jī)能增強(qiáng)，而力竭性運(yùn)動(dòng)被證明有損機(jī)體免疫應(yīng)答。一次大負(fù)荷或過度負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)可造成機(jī)體免疫功能削弱的“開窗”期（運(yùn)動(dòng)結(jié)束3～72 h）［10］，而關(guān)于運(yùn)動(dòng)性誘發(fā)免疫抑制的機(jī)理至今不甚明了。細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子涉及胞內(nèi)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它是聯(lián)系淋巴細(xì)胞激活、增殖、吞噬及細(xì)胞因子分泌等過程至關(guān)重要的中間環(huán)節(jié)。在靜息條件下，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度（［Ca2+］i）逆細(xì)胞內(nèi)外電化學(xué)梯度力作用，被控制在納摩爾級(jí)的低水平狀態(tài)。在不同類型的細(xì)胞，胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究顯示，一次急性運(yùn)動(dòng)可以引起一系列免疫參數(shù)的變化，盡管其運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)負(fù)荷有限［14］。長(zhǎng)時(shí)間、持續(xù)、中到高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制是非常明顯的［2］。研究在運(yùn)動(dòng)刺激過程中，機(jī)體免疫細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)如何以一個(gè)可靠的、有效的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)于我們了解運(yùn)動(dòng)影響機(jī)體免疫功能這樣一個(gè)生物過程是非常重要的。免疫細(xì)胞增殖可被視作評(píng)價(jià)免疫機(jī)能重要的指標(biāo)。為了探討運(yùn)動(dòng)性誘發(fā)免疫抑制的分子機(jī)制，本研究試圖調(diào)查一次性大強(qiáng)度、長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)是否能影響靜息或刺激作用下淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)、相關(guān)鈣調(diào)控基因表達(dá)及刺激劑體外誘導(dǎo)細(xì)胞增殖反應(yīng)能力。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究對(duì)象為C57BL/6雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)分組前鼠齡：12周，體重：26.0±2.5 g。動(dòng)物飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)，光照周期被控制為12 h/12 h明暗循環(huán)（07：00亮燈）。小鼠被飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)籠內(nèi)（4～6只/籠），飲食自由。室溫：21±1 ℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用獲得相關(guān)的動(dòng)物管理及使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。動(dòng)物有氧能力通過跑臺(tái)肺活量測(cè)定系統(tǒng)（定制）進(jìn)行評(píng)估。具體操作過程如下：所有的動(dòng)物首先需要適應(yīng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。最大攝氧量（VO2max）和最大跑速在正式實(shí)驗(yàn)至少7天前就被確定。動(dòng)物隨機(jī)分為3組：控制組，運(yùn)動(dòng)后即刻處死組，運(yùn)動(dòng)后3 h處死組，每組5只。運(yùn)動(dòng)小鼠在跑道內(nèi)適應(yīng)10 min時(shí)間后，執(zhí)行持續(xù)遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)至力竭。運(yùn)動(dòng)檢測(cè)開始的速度為0.20 m/s，每3 min，速度遞增0.05 m/s。運(yùn)動(dòng)小鼠執(zhí)行80%VO2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，速度為0.40±0.05 m/s運(yùn)動(dòng)直至力竭［4］。分別于運(yùn)動(dòng)后即刻和3 h，在麻醉狀態(tài)下將小鼠斷頸處死。運(yùn)動(dòng)小鼠運(yùn)動(dòng)的時(shí)間為60.0±5.0 min?？刂平M小鼠暴露在跑臺(tái)噪音中，但無運(yùn)動(dòng)，處死方式同運(yùn)動(dòng)組。

2.2 淋巴細(xì)胞分離

密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞：將一個(gè)細(xì)胞濾網(wǎng)（孔徑：100μm）置入培養(yǎng)皿，且在其中加1 mL PBS溶液；處死動(dòng)物，從其體內(nèi)取出脾臟，將其置入濾網(wǎng)上，輕輕地研磨脾臟；加1 mL PBS溶液清洗濾網(wǎng)和培養(yǎng)皿；在一個(gè)試管內(nèi)加3 mL Biocoll分離液（密度：1.077 g/mL）；小心地將細(xì)胞懸液加到分離液上；2 000 r/min離心20 min；將淋巴細(xì)胞層移出； 加PBS溶液1500 r/min離心10 min，清洗細(xì)胞2次；棄細(xì)胞上清液，重懸細(xì)胞入1 ml PBS溶液。整個(gè)過程在無菌條件下操作完成。胎盤蘭檢測(cè)細(xì)胞的活性在98%以上，流式細(xì)胞儀前向—側(cè)向散射模式確定淋巴細(xì)胞純度在99%以上。全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞。

2.3 藥劑和溶液

fura-2AM （Molecular Probes?） 溶解在二甲亞砜（DMSO），儲(chǔ)備液濃度為1 mmol/L，－80 ℃保存。洋地黃皂苷（Digitonin），植物血凝素（PHA），毒胡蘿卜素（TG）購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司。乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA），DMSO購(gòu)自 Carl Roth公司。鼠單克隆抗體CD3（OKT3）（1 mg/mL）購(gòu)自Janssen-Cilag公司。達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM），胎牛血清（FBS）購(gòu)自PAA公司。PE/Cy7 anti-mouse CD3 購(gòu)自Biolegend公司。

2.4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的檢測(cè)

檢測(cè)方法：1）細(xì)胞孵育：1 mL含9×106個(gè)淋巴細(xì)胞的含鈣緩沖液與5μL fura-2AM（儲(chǔ)備濃度：1 mmol/L）在室溫下孵育30 min，多余染料通過3次離心（1 500 r/min×10min）移除，將細(xì)胞重懸在不含鈣PBS溶液中，細(xì)胞在冰箱冷藏條件下保存；2）熒光掃描：通過應(yīng)用熒光穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)分析系統(tǒng)（Deltascan；PTI，加拿大）測(cè)定細(xì)胞懸液fura-2熒光強(qiáng)度，每次負(fù)載fura-2/AM細(xì)胞懸液（包含2.7×106個(gè)細(xì)胞），加入到熒光比色杯中，激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)為：340～380 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)設(shè)為：510 nm，雙波長(zhǎng)交替掃描，比色杯和溶液等自體熒光在實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)，在2 h內(nèi)完成fura-2負(fù)載細(xì)胞測(cè)量實(shí)驗(yàn)；3）刺激檢測(cè)：為測(cè)定在含鈣緩沖液中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，在靜息狀態(tài)下掃描比色杯熒光信號(hào)100 s以后，使用PHA（應(yīng)用濃度：20μg/mL）或者TG（應(yīng)用濃度：10μmol/L）刺激細(xì)胞650 s；為測(cè)定在不含鈣緩沖液中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，在無鈣PBS溶液（加0.1 mmol/L EGTA），掃描熒光100秒，刺激劑加入測(cè)試介質(zhì)中掃描熒光250 s，然后將CaCl2溶液（0.8 mmol/L）加入比色杯中掃描熒光350 s；（4）濃度計(jì)算：加破膜劑10 mM Digitonin，使fura-2和Ca2+結(jié)合達(dá)飽和，測(cè)得F340/F380為Rmax；加入高濃度Ca2+螯合劑EGTA（終濃度為5 mmol/L，pH8.5），以充分螯合Ca2+，使fura-2游離，測(cè)得的F340/F380為Rmin。根據(jù)Grynkiewicz等［8］方程式進(jìn)行計(jì)算：

其中，Kd為鈣離子特異性熒光探針，fura-2與Ca2+反應(yīng)的解離常數(shù)，生理?xiàng)l件下，其值是220 nmol·L–1；R為各測(cè)定點(diǎn)F340/F380熒光強(qiáng)度比值；Rmax和Rmin分別為上述測(cè)定的最大和最小熒光比值；Fmin和Fmax分別代表Ca2+為零及飽和時(shí)，在380 nm激發(fā)光下測(cè)得的fura-2熒光強(qiáng)度（F380）。

2.5 淋巴細(xì)胞增殖能力評(píng)估

根據(jù) Quah等［13］的實(shí)驗(yàn)方案，淋巴細(xì)胞重懸在包含10%（v/v）熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度為6×106/mL；小心地將細(xì)胞懸液置于15 mL錐形試管底；然后將試管水平放平；小心地在試管頂部加11μL PBS溶液；重懸1.1μL 5mmol/L CFSE儲(chǔ)存液于此PBS溶液中；迅速蓋緊試管，上下顛倒，漩渦混勻；鋁箔紙包裹試管，在室溫條件下孵育細(xì)胞5 min；在室溫條件下加入8 mL包含10%（v/ v）FBS的PBS溶液終止標(biāo)識(shí)反應(yīng)，淬滅游離CFSE；20 ℃，2 500 r/min 離心5 min，棄上清液；重復(fù)洗滌2次；單個(gè)培養(yǎng)皿中含有的細(xì)胞數(shù)為2×106，植物凝集素（10μg/mL）刺激培養(yǎng)細(xì)胞；2 mL DMEM加入100μg/mL青霉素和100μg/ mL鏈霉素及10%（v/v）胎牛血清；細(xì)胞在5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；收集培養(yǎng)細(xì)胞，PBS溶液洗滌2次，然后流式細(xì)胞儀（EPICS XL Beckman Coulter，美國(guó)）分析anti-CD3-PE Abs 標(biāo)識(shí)細(xì)胞，每個(gè)樣本至少獲取10 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。細(xì)胞增殖能力通過計(jì)算母代增殖的各子代細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行評(píng)估。流式細(xì)胞儀前向—側(cè)向散射模式評(píng)估細(xì)胞死亡率。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

2.6.1 總RNA抽提

應(yīng)用試劑盒RNeasy Mini Kit（Qiagen），按照生產(chǎn)商提供的產(chǎn)品使用說明，抽提分離冰凍裂解的CD3+淋巴細(xì)胞總RNA另外，可能的DNA污染通過RNA分離試劑盒提供的RNase- Free DNase Set消化移除。抽提的RNA被重新溶解于RNase free water，儲(chǔ)存于－80 ℃冰箱，直至使用。分離的總RNA定量及其完整性通過ND-1 000 微量紫外分光光度計(jì)（Nano-Drop Technologies）進(jìn)行分析。

2.6.2 逆轉(zhuǎn)錄

使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems），據(jù)產(chǎn)品使用說明，以0.5～1 μg總RNA為模板，加0.8 μL(25 ×，100mmol/L each) dNTP混合物，1 μL (50 U/ μL) MultiScribe?逆轉(zhuǎn)錄酶，2 μL (10×) RT隨機(jī)引物， 2μl (10×) R T 緩沖液和無菌蒸餾水至20 μL，合成第一鏈cDNA。

2.6.3 實(shí)時(shí)定量熒光PCR

mRNA表達(dá)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀iCycler（Bio-Rad）通過高靈敏DNA 熒光染料iQ SYBR Green Supermix進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條件為：1個(gè)循環(huán)95 ℃預(yù)變性3 min；42個(gè)循環(huán)95 ℃變性15 s；61 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，自動(dòng)采集熒光信號(hào)，繪制溶解曲線。所有的引物是跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)的，檢測(cè)最佳的退火溫度。各個(gè)引物序列如：基因STIM1（Stromal interaction molecule 1）正向引物：TGAAGAGTCTACCGAAGCAGA，反向引物：AGGTGCTATGTTT CACTGTTGG；基因RYR2 （Ryanodine receptor；2）正向引物：ATTATGAAGGTGGTGCC GTATCA，反向引物TTCCACTCCACGCGACTCTTA。樣本雙倍檢測(cè)。通過基因β-actin （正向引物：GTGACGTTGACATCCGTAAAGA，反向引物：GCCGGACT CATCGTACTCC）恒定表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試目標(biāo)基因cDNA水平。通過溶解曲線判斷基因表達(dá)的特異性。樣本擴(kuò)增通過循環(huán)閾值（Ct）表示。計(jì)算目標(biāo)基因的循環(huán)閾值（Cttarget）與看家基因（Ctβ-aCtin）循環(huán)閾值之間的差值（ΔCt），運(yùn)動(dòng)組和控制組特定基因表達(dá)的變化使用如下公式計(jì)算2?Δ(ΔCt)，Δ(ΔCt)=(ΔCtEG–ΔCtCG)。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 急性運(yùn)動(dòng)對(duì)PHA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子瞬態(tài)的影響

如圖1-A所示，在含鈣緩沖液中，第100 s加PHA刺激比色杯中淋巴細(xì)胞，［Ca2+］i迅速增加；如圖1-B所示，以20μg/mL PHA刺激淋巴細(xì)胞650 s后，在控制組，［Ca2+］i達(dá)到：99.04±9.047 nmol/L，而在運(yùn)動(dòng)即刻組，［Ca2+］i減至：87.17±13.020 nM。在運(yùn)動(dòng)即刻組和控制組，［Ca2+］i沒有顯著性差異（P＞0.05，n=7）；如圖1-C所示，與刺激前比較，PHA引起淋巴細(xì)胞［Ca2+］i的增幅（加PHA刺激時(shí)［Ca2+］i—刺激前［Ca2+］i），在控制組增幅為：56.27±6.236 nmol/ L，而在運(yùn)動(dòng)即刻組增幅為：34.53±7.024 nmol/L，運(yùn)動(dòng)即刻組淋巴細(xì)胞［Ca2+］i增幅與控制組相比差異具有顯著性（P＜0.05，n=7）。如圖1-D所示，在100 s時(shí)，在含有0.1 mmol/L EGTA的無鈣PBS溶液中加入PHA（應(yīng)用濃度：20μg/ml）時(shí)， ［Ca2+］i增幅非常少，在控制組和運(yùn)動(dòng)即刻組分別達(dá)到38.10±5.335 nmol/L和19.78±5.104，兩組差異具有顯著性意義（P＜0.05，n=6）。為了評(píng)估細(xì)胞外溶液Ca2+內(nèi)流對(duì)［Ca2+］i增加的貢獻(xiàn)度，在第350 s時(shí)，加入CaCl2溶液，［Ca2+］i迅速增加，這意味著胞外大量Ca2+可通過胞膜涌入細(xì)胞內(nèi)，在控制組和運(yùn)動(dòng)即刻組，PHA誘導(dǎo)的［Ca2+］i分別達(dá)到142.8±16.44 nmol/L和185.0±51.45 nmol/L，兩組差異具有顯著性意義（P＜0.05，n=6，如圖1-E）；如圖1-F，Ca2+從細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)凈釋放量在控制組和運(yùn)動(dòng)即刻組分別為28.28±5.906 nmol/L和11.82±3.919 nmol/L，差異具有顯著性（P＜0.05，n=6）；PHA誘導(dǎo)細(xì)胞外鈣離子凈流入量分別達(dá)到104.7±16.84 nM和165.3±52.95 nmol/L，差異不具有顯著性意義（P＞0.05，n=6）。

圖1 急性運(yùn)動(dòng)對(duì)PHA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子瞬態(tài)的影響Figure 1 The Effect of Treadmill Running on PHA-induced Ca2+Transient State of Lymph Cells

3.2 急性運(yùn)動(dòng)對(duì)TG誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子瞬態(tài)的影響

如圖2-A所示，在含鈣緩沖液中，以10μmol/L TG刺激淋巴細(xì)胞，在控制組，［Ca2+］i達(dá)到：511.1±38.51 nmol/L，在運(yùn)動(dòng)后3 h組達(dá)到：635.9±88.52 nmol/L，兩組不具有顯著性差異（P＞0.05，n=5）；如圖2-B所示，與刺激前［Ca2+］i比較，TG引起淋巴細(xì)胞［Ca2+］i的增幅（加TG刺激時(shí)［Ca2+］i-刺激前［Ca2+］i），在控制組為：464.9±51.53 nmol/L，而在運(yùn)動(dòng)后3 h組為：534.8±111.4 nmol/L，2組淋巴細(xì)胞［Ca2+］i的增幅差異具有顯著性（P＞0.05，n=5）。如圖2-C所示，在100 s時(shí)，在含有0.1 mmol/L EGTA無鈣PBS溶液中加入TG（應(yīng)用濃度：10μmol/L）時(shí)，［Ca2+］i增幅非常少，在控制組和運(yùn)動(dòng)后3 h處死組分別達(dá)到42.14±9.177 nmol/L和13.25±5.828 nmol/L，兩組差異具有顯著性（P＜0.05，n=7）。為了評(píng)估細(xì)胞外溶液Ca2+內(nèi)流對(duì) ［Ca2+］i增加的貢獻(xiàn)度，在第350 s時(shí)，加入CaCl2溶液，［Ca2+］i迅速增加，這意味著胞外大量Ca2+可通過胞膜涌入細(xì)胞內(nèi)，在控制組和運(yùn)動(dòng)后3 h組，TG誘導(dǎo)［Ca2+］i分別達(dá)到269.4±60.93 nmol/L和169.4±47.08 nmol/ L，兩組差異不具有顯著性（P＞0.05，n=7）（如圖2-C）；如圖2-D，Ca2+從細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)凈釋放量在控制組和運(yùn)動(dòng)后3 h組分別為23.26±5.161 nmol/L和5.300±1.709 nmol/L，差異具有顯著性（P＜0.05，n=7）；TG誘導(dǎo)細(xì)胞外鈣離子凈流入量分別達(dá)到227.3±57.89 nmol/L和156.2±50.44 nmol/L，差異不具有顯著性（P＞0.05，n=7）。

圖2 急性運(yùn)動(dòng)對(duì)TG誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子瞬態(tài)的影響Figure 2 The Effect of Treadmill Running on TG-induced Ca2+Transient State of Lymph Cells

3.3 急性運(yùn)動(dòng)對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

為了評(píng)估淋巴細(xì)胞的增殖能力，用CFSE標(biāo)識(shí) CD3+ T細(xì)胞， 分析各代細(xì)胞增殖數(shù)。如圖3所示，在運(yùn)動(dòng)后3 h組，當(dāng)應(yīng)用植物血凝素體外刺激淋巴細(xì)胞時(shí)，其增殖能力被顯著抑制（P＜0.05，n=10）。

3.4 急性運(yùn)動(dòng)對(duì)淋巴細(xì)胞鈣調(diào)基因表達(dá)的影響

如圖4所示，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的相對(duì)定量法分析，控制組基因表達(dá)設(shè)定為100%，在運(yùn)動(dòng)后3 h組與控制組相比較，STIM1基因表達(dá)不具有顯著性差異（P＞0.05，n=5），而RYR2基因表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，n=5）。

4 分析與討論

我們知道，運(yùn)動(dòng)可以影響機(jī)體免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能顯型。在外部刺激作用下，淋巴細(xì)胞增殖是細(xì)胞免疫反應(yīng)一個(gè)至關(guān)重要的部分。在許多實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，多克隆有絲分裂原，如植物血凝素，可以用作刺激劑，借此評(píng)估淋巴細(xì)胞增殖能力。本研究利用的熒光染料CFSE染色結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)分析方法，是一種新型研究淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)的方法。CFSE是可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，高效、流行的監(jiān)控淋巴細(xì)胞增殖過程的一種新型染料。CFSE以熒光染料（羧基熒光素）共價(jià)的方式標(biāo)記長(zhǎng)壽命的細(xì)胞內(nèi)蛋白分子，水解發(fā)出綠色熒光。它標(biāo)記淋巴細(xì)胞群具有高熒光強(qiáng)度，特別低的不一致性，加上其低的細(xì)胞毒性，使其成為評(píng)估細(xì)胞增殖水平的理想染料。因?yàn)樗且环N基于熒光素的染料，與其他眾多的熒光染料兼容使其適用于多色流式細(xì)胞儀分析［16］。

先前已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)使用人體或動(dòng)物模型研究急性運(yùn)動(dòng)對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力的影響。例如：Kwak等［5］，Randall等［15］，Lin等［6］報(bào)道了急性運(yùn)動(dòng)引起伴刀豆凝集素A（Con A）刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力降低；Potteiger等［12］，Mazzeo等［7］，Gleeson等［3］等也研究顯示，急性運(yùn)動(dòng)引起T細(xì)胞增殖能力下降；Tian［17］報(bào)道相比運(yùn)動(dòng)前水平，急性運(yùn)動(dòng)下調(diào)淋巴細(xì)胞增殖能力；人體實(shí)驗(yàn)研究顯示，在急性運(yùn)動(dòng)結(jié)束2 h到幾小時(shí)內(nèi)，PHA和 Con A刺激會(huì)引起的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)水平下降［9］。有研究表明，淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)與運(yùn)動(dòng)負(fù)荷有關(guān)。Siedlik指出，持續(xù)時(shí)間超過1 h的急性運(yùn)動(dòng)，不管其運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度如何，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)都會(huì)有一個(gè)更大幅度的抑制效應(yīng)［16］；Dohi等［1］報(bào)道，抗阻力運(yùn)動(dòng)僅減少在大強(qiáng)度組受試者淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)水平；縱向研究顯示，在高水平運(yùn)動(dòng)員，T淋巴功能對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷非常敏感，隨著負(fù)荷加大，其增殖反應(yīng)水平下降［19］；然而，Nehlsen-Cannarella 等［8］報(bào)道，45 min步行，相比靜坐休息，沒有引起自發(fā)的或Con A刺激淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力顯著變化，但急性運(yùn)動(dòng)1.5 h以后，相比靜息條件而言，PHA刺激淋巴細(xì)胞增殖能力有一降低的趨勢(shì)。本研究所采用的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度是VO2max80%，長(zhǎng)時(shí)間力竭性運(yùn)動(dòng)被證明引起PHA刺激淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力下降，與上述研究報(bào)道一致。當(dāng)然也有研究報(bào)道30 min 亞極量強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)PHA刺激淋巴細(xì)胞增殖能力沒有影響［18］?？墒?，急性運(yùn)動(dòng)下調(diào)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力的分子機(jī)制是什么呢？

圖3 急性運(yùn)動(dòng)對(duì)刺激劑誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增值水平的影響Figure 3 The Effect of Treadmill Running on Agonist-induced Cellular Differentiation of Lymph Cells

圖4 急性運(yùn)動(dòng)對(duì)淋巴細(xì)胞STIM1和RYR2基因表達(dá)的影響Figure 4 The Effect of Treadmill Running on Expression of STIM1 and RYR2 of Lymph Cells

Ca2+是非常重要的“第二信使”分子，它是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)焦點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，即［Ca2+］i，其增減可成為眾多細(xì)胞生化反應(yīng)“啟”和“閉”的開關(guān)，它廣泛參與細(xì)胞功能反應(yīng)過程。細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光指示劑及其雙波長(zhǎng)測(cè)定模式的研發(fā)開啟了細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究一次革命。細(xì)胞內(nèi)Ca2+指示劑的特異性及其對(duì)其他大多數(shù)生理離子不敏感性提供了可直接測(cè)量活細(xì)胞［Ca2+］i技術(shù)，這種熒光指示劑是以非破壞性的方式負(fù)載細(xì)胞，而且雙波長(zhǎng)測(cè)定可大大減少染料濃度不一，負(fù)載不均勻，滲漏，光照，光漂白等因素影響，提供改良的信號(hào)和噪聲比，更高的時(shí)間分辨率，更穩(wěn)定，可重現(xiàn)的結(jié)果。本研究使用的fura-2，作為一種比率測(cè)量Ca2+的鈣熒光指示劑，它對(duì)Ca2+有高敏感性，而對(duì)Mg2+敏感性小，使其可在幾十微摩爾級(jí)準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i。

在本研究中，我們觀察到在刺激劑（PHA，TG）作用下，淋巴細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+變化的動(dòng)態(tài)學(xué)過程，它可分兩個(gè)階段：在刺激劑加入后，［Ca2+］i立刻增加，并經(jīng)過數(shù)十秒達(dá)到一個(gè)高的水平（第1階段）；然后逐漸降低，但是沒有恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，仍然保持一個(gè)增加的趨勢(shì)并穩(wěn)定在一水平（第2階段）。本研究結(jié)果顯示，急性運(yùn)動(dòng)結(jié)束即刻，PHA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化幅度和Ca2+釋放率下降，運(yùn)動(dòng)結(jié)束3 h，TG誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞內(nèi)“鈣庫(kù)” Ca2+釋放率降低。這意味著急性運(yùn)動(dòng)引起淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的減弱。這些研究建議，急性運(yùn)動(dòng)對(duì)淋巴細(xì)胞鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響可能存在時(shí)相關(guān)系。

T淋巴細(xì)胞表面的特異性抗原受體（TCR）是一種與細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員耦合的受體，它與CD3緊密聯(lián)結(jié)形成蛋白復(fù)合物。在抗原結(jié)合T細(xì)胞受體，形成TCR-CD3復(fù)合物以后，激活酪氨酸激酶依賴性的肌醇磷脂酶C（PLC-γ），導(dǎo)致肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）形成。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3配體門控鈣通道結(jié)合，開啟鈣通道促使Ca2+從胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放，繼而引起持續(xù)的胞外Ca2+跨膜涌入，使胞內(nèi)Ca2+濃度升高。刺激終止以后，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和質(zhì)膜Ca2+-ATP酶（SERCA，PMCA）作用下，［Ca2+］i被調(diào)控恢復(fù)到刺激前水平。在免疫細(xì)胞，胞外Ca2+內(nèi)流主要由胞膜上鈣釋放激活鈣通道（CRAC）完成， Orai蛋白是組成CRAC通道的關(guān)鍵蛋白，STIM（Stormal interaction molecule）分子是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子傳感器，STIM分子（包括STIM1和STIM2兩個(gè)亞型，而STIM1是最重要的）能感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)鈣離子濃度變化，與Orai通道相互作用并激活Orai通道，最后開放CRAC通道，引起細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流。RYR2是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+釋放通道基因，本研究顯示，急性運(yùn)動(dòng)下調(diào)其核酸表達(dá)水平，這可以進(jìn)一步解釋急性運(yùn)動(dòng)引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的機(jī)制。本研究顯示，在急性運(yùn)動(dòng)3 h以后， RyR通道基因表達(dá)下調(diào)可能致使“鈣庫(kù)”釋放Ca2+水平下降，抑制Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，因而降低淋巴細(xì)胞增殖分化能力。

5 小結(jié)

綜上所述，急性大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)下調(diào)淋巴細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)膜鈣通道基因表達(dá)，從而抑制胞內(nèi)鈣離子釋放以及胞內(nèi)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，相應(yīng)地降低刺激劑誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖能力，即：淋巴細(xì)胞免疫功能削弱。這可能是急性運(yùn)動(dòng)引起機(jī)體免疫抑制的一個(gè)重要分子機(jī)制。

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The Effect of Treadmill Running With High Load on the Transient State of Endocellular Calciumion，the Expression of Relative Channel Genes and Agonist-stimulated Cellular Differentiation in Lymph Cells

LIU Ren-yi1，LI Yi-xin2

The cellular differentiation response of lymph cells is usually used to assess immune cell function. Physical activity-induced immunosuppression is a hot topic in sports medicine research，but its mechanism is still unclear. The study examines the effect of a single bout of treadmill running on the transient state of endocellular calcium ion，expression of the genes，STIM1 and RYR2 and PHA-stimulated cellular differentiation in lymph cells in order to investigate the molecular mechanism of physical activity with high load-induced immunosuppression. In this study，matched male mice were assigned to 3 groups of chontrol，0 h and 3 h after a single bout of running，randomly. The running mice carried out a single bout of treadmill-running with 80% Vo2max. Lymph cells were isolated from animal spleens. Endocellular calcium ion was decided by using a fl uorospectrophotometer to measure fura-2(AM)-dyed cell suspension. The combination of fl ow cytometry with carboxy-f l uorescein succinimidyl ester (CFSE) loading method was used to decide cellular differentiation. The expressions of STIM and RYR genes were determined by real-time PCR. In this study，we found that PHA-induced change of ［Ca2+］i；and endocellular Ca2+release and were signif i cantly reduced (P＜0.05) at 0 h after treadmill running；TG-induced endocellular Ca2+release was signif i cantly reduced (P＜0.05)，agonist-induced cellular different -iation were signif i cantly decreased at 3 h after treadmill running (P＜0.05)，and RYR gene expression of lymph cells was signif i cantly reduced (P＜0.05) at 3h after treadmill running. The study suggests that a single bout of intensive running could cause impairment of endocellular calcium ion release and calcium signaling transduction，expression of the relative channel genes and cellular differentiation in lymph cells；the mechanism of physical activity with high load-induced immunosuppression could be related with impairment of the transient state of endocellular calcium ion.

physical activity with high load，calcium ion，channels，lymph cells

G804.7

A

1002-9826（2017）03-0048-07

10. 16470/j. csst. 201703008

2016-07-12；

2017-04-06

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CUG150607)。

劉仁儀，男，副教授，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與免疫，Tel：027-67883652，E-mail：renyi.liu@foxmail. com。

1.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)，湖北 武漢430074；2.湘南學(xué)院，湖南 郴州423000

1.China University of Geosciences(Wuhan) ，Wuhan 430074，China；2.Xiangnan University，Chenzhou 423000，China.