任 帥，李異玲

1.沈陽市第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽110044；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科

乙醛脫氫酶2基因多態(tài)性與酒精性肝病的相關(guān)性研究

任 帥1，李異玲2

1.沈陽市第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽110044；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科

目的 探討酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)與乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)基因多態(tài)性的相關(guān)性。方法 收集87例長期飲酒患者，其中44例為ALD患者，43例為長期嗜酒非酒精性肝病(non-ALD,NALD)患者，30名健康對照者，抽取其外周血標(biāo)本提取DNA，DNA微陣列芯片法對ALDH2進(jìn)行基因分型，分析ALDH2基因型與ALD的關(guān)系。結(jié)果 ALDH2各基因型頻率在ALD組與健康對照組中分布差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，嗜酒NALD組與健康對照組中ALDH2基因頻率分布差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)；ALDH2基因多態(tài)性與飲酒后發(fā)生潮紅綜合征相關(guān)，與GGT、AST有相關(guān)性。結(jié)論 乙醛脫氫酶不同基因型與ALD的發(fā)生有一定相關(guān)性。

乙醛脫氫酶2；酒精性肝??；乙醛脫氫酶2野生型基因；乙醛脫氫酶突變型基因

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，研究[1]報(bào)道，在中國，15～69歲人群中的飲酒率高達(dá)35.7%。酒精性肝硬化在肝硬化的病因構(gòu)成比從1999年的10.8%上升到2003年的24.0%[2]。

酒精主要在肝臟通過氧化代謝反應(yīng)解毒和消除。乙醇首先通過乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)代謝為乙醛，再由乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)通過催化乙醛產(chǎn)生乙酸，最終分解為水和二氧化碳。其中，ALDH是乙醛代謝的關(guān)鍵酶，在乙醛代謝的過程中起著不可替代的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，乙醛脫氫酶第12個(gè)外顯子存在一個(gè)G/A單核苷酸多態(tài)(在其相應(yīng)編碼的蛋白質(zhì)第504氨基酸中Glu/Lys多態(tài))的突變型會(huì)嚴(yán)重降低ALDH2的酶活性[4]。

本研究通過檢測ALDH2各等位基因在ALD組、嗜酒非酒精性肝病(non-ALD,NALD)組及對照組的分布頻率及分析比較，旨在探討不同ALDH2基因型與ALD的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2014年-2016年中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科住院就診的男性患者87例，其中，ALD患者44例，平均年齡(53.27±11.70)歲，ALD診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2010年酒精性肝病診療指南[2]。長期嗜酒無ALD患者43例，每日飲含乙醇量≥100 g，均連續(xù)5年以上，肝炎病毒標(biāo)志物均陰性，肝功能檢查正常，肝臟超聲檢查正常，臨床檢查無肝臟疾病癥狀及體征。同時(shí)收集30名健康對照者，無飲酒史，無肝病史，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心納入。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2010年酒精性肝病診療指南[2]：(1)有長期飲酒史，一般超過5年，折合乙醇量男性≥40 g/d，女性≥20 g/d，或2周內(nèi)有大量飲酒史，折合乙醇量>80 g/d。但應(yīng)注意性別，遺傳易感性等因素的影響。乙醇量(g)換算公式=飲酒量(ml)×乙醇含量(%)×0.8。(2)臨床癥狀為非特異性，可無癥狀，或有右上腹脹痛、食欲不振、乏力、體質(zhì)量減輕、黃疸等；隨著病情加重，可有神經(jīng)精神癥狀和蜘蛛痣、肝掌等表現(xiàn)。(3)血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽紅素(TBIL)、凝血酶原時(shí)間(PT)、平均紅細(xì)胞容積(MCV)和缺糖轉(zhuǎn)鐵蛋白(CDT)等指標(biāo)升高。其中AST/ALT>2、GGT升高、MCV升高為ALD的特點(diǎn)，而CDT測定雖然較特異但臨床未常規(guī)開展。禁酒后這些指標(biāo)可明顯下降，通常4周內(nèi)基本恢復(fù)正常(但GGT恢復(fù)較慢)，有助于診斷。(4)肝臟B超或CT檢查有典型表現(xiàn)。(5)排除嗜肝病毒現(xiàn)癥感染及藥物、中毒性肝損傷和自身免疫性肝病等。符合第1、2、3項(xiàng)和第5項(xiàng)或第1、2、4項(xiàng)和第5項(xiàng)可診斷ALD；僅符合第1、2項(xiàng)和第5項(xiàng)可疑診ALD。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝功能檢查正常，肝臟超聲檢查正常，臨床檢查無肝臟疾病癥狀及體征。

1.3 生化指標(biāo)所有患者均完善個(gè)人資料，包括年齡、性別、飲酒史、既往疾病史。按臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生化檢測，抽取清晨空腹靜脈血3～5 ml，測定 ALT、AST、 GGT水平。

1.4 基因分型方法納入患者均于我院檢驗(yàn)科進(jìn)行ALDH2基因檢測：使用ALDH2(Glu504Lys)基因檢測試劑盒(上海百傲科技有限公司)抽取外周血清標(biāo)本行DNA提取，采用DNA微陣列芯片法對ALDH2進(jìn)行基因分型。

檢測結(jié)果有3種：野生型基因(ALDH2G/G)、雜合突變型(ALDH2G/A)、純合突變型(ALDH2A/A)。其中突變純合子型只檢出1例，數(shù)量較少，與突變雜合型合并成突變型。

2 結(jié)果

2.1 基本資料ALD組年齡高于嗜酒NALD組和健康對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ALD組和嗜酒NALD組與健康對照組的 ALT、AST、GGT比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 各組肝臟酶學(xué)指標(biāo)的比較

Tab 1 Comparison of indexes of liver enzyme in each group

組別例數(shù)年齡(x-±s,歲)AST(mmol/L)ALT(mmol/L)GGT(mmol/L)ALD組4453.27±11.7090.36(14～812)86.64(9～1111)221.18(13～1521)嗜酒非NALD組4351.98±9.6519.00(7～35)21.16(8～46)41.86(12～200)健康對照組3048.37±10.3423.57(13～81)28.80(9～131)31.00(9～109)P值 >0.05 <0.05 <0.05 <0.05

2.2 ALDH2基因多態(tài)性與ALD相關(guān)性與健康對照組比較，ALD組的野生型基因比例顯著增多,突變型基因所占比例顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；嗜酒NALD組的野生型基因比例明顯增多，突變型基因比例減少，差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。與ALD組比較,長期嗜酒NALD組的突變型基因比例明顯增高,差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。與健康對照組比較，ALD組G型等位基因所占比例明顯增多，A等位基因頻率比例明顯減少。各組的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡。通過卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALD組的G等位基因頻率與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；嗜酒NALD組與對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01，見表2～3)。

表2 各組ALDH2基因型頻率[例數(shù)(%)]

Tab 2 Genotype frequency of ALDH2 in each group[n(%)]

組別例數(shù)基因型頻率野生型(ALDH2G/G)突變型(ALDH2G/A)χ2值P值A(chǔ)LD組4441(93.2)3(6.8)16.01<0.01嗜酒NALD組4333(76.7)10(23.3)4.39>0.01健康對照組3016(53.3)14(46.7)--

表3 各組ALDH2等位基因頻率[例數(shù)(%)]

Tab 3 Allele frequency of ALDH2 in each group[n(%)]

注：ALDH2基因型等位基因符合Hardy-Weinberg平衡。根據(jù)公式：等位基因頻率(%)=(2×純合子+雜合子)/2÷受檢例數(shù)。

2.3 ALDH2基因多態(tài)性與潮紅綜合征的相關(guān)性與野生型基因相比較，突變型基因飲酒后發(fā)生潮紅綜合征的比例明顯增加(0.59vs0.19 )，無潮紅綜合征者所占比例明顯減少(0.41vs0.81)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 ALDH2基因多態(tài)性與GGT、AST的相關(guān)性按基因型分組檢測,攜帶G/G基因型與攜帶G/A基因型患者相比，GGT平均值變化幅度明顯高于AST和ALT(110.70vs57.43vs46.74)(P=0.001)、AST(P<0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過Spearman相關(guān)分析得出，G等位基因與GGT及AST之間均有相關(guān)性(P<0.05)，GGT相關(guān)系數(shù)均明顯高于AST(0.305vs0.187)。

3 討論

ALD包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及肝硬化。酒精一直被認(rèn)為是慢性肝病的一個(gè)危險(xiǎn)因素[5]。長期酗酒顯著抑制線粒體ALDH的活性，甚至促進(jìn)乙醇氧化為乙醛，導(dǎo)致組織與血漿中乙醛水平顯著提高[6]。酗酒者肝臟首先發(fā)生脂肪變性，當(dāng)炎癥及肝細(xì)胞的損傷加重的情況下發(fā)展為酒精性肝炎。在長期酒精攝入的情況下，細(xì)胞外膠原蛋白和其他基質(zhì)蛋白的積累，導(dǎo)致肝纖維化，并逐漸發(fā)展為肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌[7]。

ALDH通過催化乙醛產(chǎn)生無毒性的酸性物質(zhì)來解除乙醛的毒性。目前發(fā)現(xiàn)ALDH的同工酶有19種，常見的有ALDH 1～44種。其中，ALDH2在人體內(nèi)代謝乙醛的能力最強(qiáng)[8]。研究顯示，部分人群由于ALDH2 的第12個(gè)外顯子出現(xiàn)單堿基突變，導(dǎo)致氨基酸序列第504位上的氨基酸Glu被Lys取代，致使該酶的催化能力下降。ALDH2包含2種等位基因(G、A)，可組成3種基因型，包括正?；钚缘囊吧突騁G(ALDH2×1/×1)、部分活性(即10%～45%正?；钚?的雜合突變型基因GA(ALDH2×1/×2)和幾乎無活性(即1%～5%正?；钚?的純合突變型基因(ALDH2×2/×2)[9]。

酒精代謝速率在帶有A等位基因者明顯下降。在人類肝臟不同ALDH2基因型中，無活性變異基因的線粒體ALDH2，因酶活性及蛋白成分的雙重改變，導(dǎo)致小劑量的酒精消費(fèi)后即可出現(xiàn)血液中乙醛濃度升高。且ALDH2基因在ALDH2×1/×1型基因者的酶活性的降低更遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過ALDH2×1/×2，故ALDH2×1/×1型基因者飲酒后，血液中乙醛濃度明顯升高[10]。由于乙醛的迅速積累，促進(jìn)人體兒茶酚胺釋放增多，會(huì)產(chǎn)生顏面、頸部及前胸皮膚潮紅、心跳過速、惡心、嘔吐等不適，我們將之稱為“潮紅綜合征”[11]?！俺奔t綜合征”所產(chǎn)生的不適癥狀使該類個(gè)體不易接受大量酒精飲品，導(dǎo)致ALD幾率減少。突變型等位基因ALDH2這種較強(qiáng)的自身防御保護(hù)作用，會(huì)大大降低患ALD的風(fēng)險(xiǎn)[12]。

ALDH2基因多態(tài)性存在明顯的種族差異，迄今為止，ALDH2×2/×2型基因僅發(fā)現(xiàn)于亞洲人，而歐洲人乙醛脫氫酶則主要以ALDH2×1/×1型基因形式存在[13]。約有45%的亞洲人，特別是日本人，是A等位基因攜帶者，編碼ALDH2無活性酶。ALDH2×2/×2幾乎完全防止發(fā)展酗酒,但ALDH2×1/×2為部分的保護(hù)(約60%)。然而，約10%的日本酗酒者發(fā)展為酒精相關(guān)性疾病，盡管具有無效的ALDH2基因編碼的ALDH2×1/×2或ALDH2×2/×2[14]?？梢?，ALDH2基因多態(tài)性與ALD的發(fā)生之間存在緊密相關(guān)性，個(gè)體間遺傳差異是酗酒者對ALD是否易感的基礎(chǔ)。

近期有歐美研究者研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2基因的多態(tài)性與飲酒反應(yīng)及飲酒量無關(guān),而與酒精依賴程度存在關(guān)聯(lián)。他們確認(rèn)，是 ADH基因多態(tài)性影響歐洲人酒精攝入和飲酒反應(yīng)及ALD的發(fā)生、發(fā)展[15]。

此外，研究顯示[16]，無活性的A變異基因可致結(jié)腸黏膜通透性提高，乙醛在腸道黏膜大量累積，破壞腸道黏膜屏障功能，使腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接和屏障功能障礙。飲酒導(dǎo)致腸道通透性和細(xì)菌產(chǎn)物遷移的增加這種保護(hù)途徑可以解釋70%的酗酒者不發(fā)展為嚴(yán)重酒精性肝損傷的原因[17]。

雖然不同基因型對ALD的發(fā)展有著一定的影響，但一些其他的危險(xiǎn)因素也發(fā)揮著重要作用。例如，性別、肥胖[18]、吸煙[19]和飲酒模式[20]等。近年來已提出許多其他危險(xiǎn)因素影響著ALD的發(fā)展。同時(shí)，最近的證據(jù)表明：ALDH2基因的遺傳多態(tài)性可能與癌癥易感性顯著相關(guān),如結(jié)腸癌、食管癌、肝癌。作為一種新穎的生物標(biāo)記,ALDH2在今后許多腫瘤的篩查、診斷、治療、預(yù)后及評估中都起到極其重要的作用[21]。 在酒精性肝硬化中，ALDH2基因多態(tài)性的調(diào)查與乙醇消費(fèi)也可用于肝癌發(fā)展的預(yù)測[22]。

本研究表明：G等位基因者在ALD組更普遍。在嗜酒組及ALD組均未檢測出ALDH2×2/×2純合子，說明G等位基因顯著提高ALD的發(fā)病率。因?yàn)锳LDH2×1/×1具有正常的催化能力，故相較于ALDH2×1/×2、ALDH2×2/×2型基因,酒精代謝在ALDH2×1/×1型基因者顯著加速。G等位基因者因飲酒后體內(nèi)緩慢產(chǎn)生的有限乙醛迅速轉(zhuǎn)化為乙酸，故缺乏對飲酒行為的抵制行為，其飲酒量和飲酒頻率均偏高，從而導(dǎo)致酒精高濃度長時(shí)間停留在體內(nèi)，加重肝臟受累，發(fā)展成ALD。本實(shí)驗(yàn)檢測到的ALDH2×2/×2基因型極少，分析原因，可能由于樣本量較小。迄今為止，沒有ALD相關(guān)的大規(guī)模的、精密設(shè)計(jì)的、全基因組的相關(guān)研究，ALDH2基因多態(tài)性與酒精相關(guān)疾病的關(guān)系還有待大樣本試驗(yàn)證實(shí)。

本課題通過檢測ALDH2各等位基因在對照組、嗜酒無肝病組、ALD組的分布頻率進(jìn)行分析比較，基因多態(tài)性結(jié)果表明：ALDH2×1/×1型基因與ALD的發(fā)生及肝臟酶學(xué)變化相關(guān)，是ALD發(fā)生的易感基因。ALDH不同基因型與飲酒后出現(xiàn)的潮紅綜合征也存在一定關(guān)系。在ALD患者中，不僅應(yīng)該限制飲酒，同樣需要進(jìn)行ALDH2基因型的篩查。減少飲酒，增加防護(hù)意識，有助于減小罹患酒精性相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2017.01.025

Correlation study between polymorphism of aldehyde denydrogenase 2 gene and alcoholic liver disease

REN Shuai1, LI Yiling2

1.Department of Gastroenterology, Shenyang Tenth People’s Hospital,Shengyang 110044; 2.Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of China Medical University, China

Objective To investigate the correlation between the alcoholic liver disease (ALD) and polymorphism of aldehyde dehydrogenase 2 gene (ALDH2).Methods Eighty-seven cases of chronic alcohol drinking history patients were collected,including 44 cases of ALD, 43 cases of long-term drinking NALD patients. In addition, 30 cases of healthy control subjects were selected. DNA was extracted from peripheral blood samples. And DNA microarray chip was carried out to analyze the correlatior between ALDH2 genotype and ALD.Results Different genotypes frequency distribution of ALDH2 had a statistically significant difference between ALD group and healthy control group (P<0.01).However, there was no statistically significant difference between long-term drinking NALD group and healthy control group (P>0.01).ALDH2 genotypes were associated with alcohol flushing symptoms occurred after drinking, and they were related to GGT and AST.Conclusion There is a certain correlation between the different genotypes of ALDH and the occurrence of ALD.

Aldehyde dehydrogenase 2; Alcoholic liver disease; Aldehyde dehydrogenase 2 wild type gene; Aldehyde dehydrogenase mutant type gene

任帥，碩士研究生。E-mail：934663287@qq.com

李異玲,博士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：脂肪性肝病的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail：lyl-72@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.01.024

R575.5

A

1006-5709(2017)01-0086-04

2016-03-29