梁燕冰，覃月秋，蔣玉潔，黃霞，李軍 ，彭丁偉， 黃雨晴， 廖品琥

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色533000)

膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體基因rs867186A/G位點(diǎn)多態(tài)性觀察

梁燕冰，覃月秋，蔣玉潔，黃霞，李軍 ，彭丁偉， 黃雨晴， 廖品琥

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色533000)

目的 觀察膿毒癥患者外周血內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)基因rs867186A/G位點(diǎn)多態(tài)性。方法 64例膿毒癥患者(其中男38例、女26例)為膿毒癥組，113例健康體檢者為對(duì)照組。采集觀察組、對(duì)照組5 mL外周靜脈血，檢測(cè)兩組外周血EPCR基因rs867186A/G位點(diǎn)的多態(tài)性，采用ELISA法檢測(cè)兩組血漿可溶型EPCR(sEPCR)。分析EPCR基因rs867186A/G位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)膿毒癥患者血漿sEPCR表達(dá)及病情嚴(yán)重程度的影響 結(jié)果 膿毒癥組AA、AG、GG三種基因型和A、G等位基因的分布頻率分別為81.2%、17.2%、1.6%、89.8%、10.2%，對(duì)照組分別為83.2%、16.8%、0、91.6%、8.4%，兩組間EPCR基因型及等位基因頻率間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。EPCR基因 rs867186A/G位點(diǎn)攜帶等位基因A的男性較攜帶相同等位基因的女性患膿毒癥的風(fēng)險(xiǎn)高(OR=1.735；95%CI: 1.063～2.833,P<0.05)。膿毒癥組血漿sEPCR水平高于對(duì)照組但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。不同rs867186A/G位點(diǎn)基因型膿毒癥患者血漿sEPCR水平、病情嚴(yán)重程度間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 膿毒癥患者外周血EPCR基因rs867186A/G位點(diǎn)上多為AA基因型或A等位基因。EPCR基因rs867186A/G位點(diǎn)多態(tài)性可能與膿毒癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)。

膿毒癥；內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體；基因多態(tài)性

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征[1]，發(fā)病率高，一旦發(fā)生病情較重，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致感染性休克、多器官功能障礙綜合征等，患者病死率高[2]。目前膿毒癥已成為ICU危重患者最常見(jiàn)的死亡原因。深入研究膿毒癥的發(fā)病原因和機(jī)制對(duì)其治療具有重要意義。單核苷酸基因多態(tài)性作為人群、地域的一種標(biāo)志，對(duì)人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展有著重要影響。研究表明膿毒癥的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素密切相關(guān)[3]，內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)基因多態(tài)性與膿毒癥[4]、血栓性疾病[5]、乳腺癌[6]、瘧疾[7]等疾病的臨床預(yù)后有關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)，EPCR在內(nèi)皮損傷和炎癥病變的發(fā)生過(guò)程中起重要作用[3]。但目前關(guān)于EPCR基因多態(tài)性與膿毒癥相關(guān)性方面報(bào)道較少。我們觀察了膿毒癥患者外周血EPCR基因rs867186A/G位點(diǎn)的多態(tài)性，分析其與血漿可溶型EPCR(sEPCR)水平的關(guān)系，旨在為膿毒癥患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科2014年7月～2015年12月入院的膿毒癥患者(膿毒癥組)64例，其中男38例、女26例，年齡(57.45±15.80)歲，均符合2012年國(guó)際膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，其中嚴(yán)重膿毒癥17例、膿毒性休克41例。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①年齡<18歲或>80歲；②心臟停搏者；③需行急診手術(shù)者；④不愿接受中心靜脈置管或有置管禁忌者。另選取同期門(mén)診的健康體檢人群(對(duì)照組)113例，其中男82例、女31例，年齡(55.3±11.7)歲，全部體檢人群臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。所有納入對(duì)象間均無(wú)血緣關(guān)系，兩組性別、年齡比例間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，納入者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 兩組外周血EPCR基因rs867186A/G位點(diǎn)多態(tài)性觀察 于觀察組入院24 h內(nèi)用EDTA-K2抗凝采血管收集5 mL外周靜脈血，對(duì)照組采集清晨空腹靜脈血。①采用離心柱法提取兩組外周血DNA，-70 ℃保存?zhèn)溆?，試劑盒為DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen, Germany)，所有操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；②采用單堿基延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段，EPCR基因rs867186A/G 的序列來(lái)自NCBI的核苷酸序列(Gene ID: 10544)，采用Primer3 軟件設(shè)計(jì)(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)引物，并由上海天昊生物科技有限公司合成。rs867186上游引物：5′-ATGGACTCCTTGGGGGCCTATT-3′；下游引物：5′-GTGGGCAGATGTGGGAGAAGAA-3′， 20 μLPCR反應(yīng)體系包括：1×GC-I buffer(TaKaRa)、3.0 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTP、 1 μmmol/L HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)、1 μL 樣本DNA、1 μL多重PCR 引物。PCR循環(huán)程序：95 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃ 變性 20 s， 65 ℃ 退火 40 s， 72 ℃ 延伸 1.5 min，重復(fù) 11 個(gè)循環(huán); 然后 94 ℃ 變性20 s，59 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 1.5 min，重復(fù) 24 個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 延伸2 min，產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆?；③使用ABI3730XL測(cè)序儀對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物(SNaPshot Multiplex Kit, ABI, USA)進(jìn)行測(cè)序，所得的原始數(shù)據(jù)使用GeneMapper 4.1(Applied Biosystems Co, Ltd, USA)進(jìn)行分析。

1.3 兩組血漿可溶型EPCR(sEPCR)檢測(cè) 于觀察組入院24 h內(nèi)用采血管收集5 mL外周靜脈血，對(duì)照組采集清晨空腹靜脈血。自然凝固后，離心取上清，-70 ℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測(cè)兩組sEPCR，所有操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血EPCR基因 rs867186A/G位點(diǎn)多態(tài)性 兩組外周血EPCR基因 rs867186A/G位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)樣本具有群體代表性。基因分型結(jié)果表明，rs867186A/G位點(diǎn)存在AA、AG、GG三種基因型。兩組外周血EPCR基因 rs867186A/G位點(diǎn)多態(tài)性比較見(jiàn)表1。不同性別兩組外周血EPCR基因 rs867186A/G位點(diǎn)多態(tài)性比較見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，EPCR基因 rs867186A/G位點(diǎn)攜帶等位基因A的男性較攜帶相同等位基因的女性患膿毒癥的風(fēng)險(xiǎn)高(OR=1.735；95%CI: 1.063～2.833,P<0.05)。

2.2 兩組血漿sEPCR水平比較 膿毒癥組、對(duì)照組血漿sEPCR水平分別為(100.52±95.60)、(81.84±49.19)ng/mL，二者比較，P>0.05。膿毒癥患者男性、女性血漿sEPCR水平分別為(110.35±103.89)、(86.16±81.85)ng/mL，二者比較，P>0.05。

表1 兩組外周血EPCR基因 rs867186A/G位點(diǎn)基因型和等位基因比較(%)

表2 不同性別兩組外周血EPCR基因 rs867186A/G位點(diǎn)基因型和等位基因比較(%)

2.3 膿毒癥患者外周血EPCR基因rs867186A/G位點(diǎn)多態(tài)性與血漿sEPCR水平、病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性 不同rs867186A/G位點(diǎn)基因型膿毒癥患者血漿sEPCR水平、病情嚴(yán)重程度間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)表3、4。

表3 不同rs867186A/G位點(diǎn)基因型膿毒癥患者血漿sEPCR水平比較

注：因rs867186位點(diǎn)女性GG基因型僅1例。

表4 不同病情膿毒癥患者rs867186A/G位點(diǎn)基因型比較(例)

注：因GG基因型例數(shù)較少，與AG基因型合并。

3 討論

不同地區(qū)、種族的人群基因多態(tài)性之間存在明顯差異，基因多態(tài)性與疾病之間的關(guān)系是目前研究的熱點(diǎn)[9～11]。EPCR可通過(guò)激活蛋白C(PC)發(fā)揮抗炎、抗凋亡、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞屏障等作用[12，13]。人類(lèi)EPCR基因(PROCR)位于20號(hào)染色體q11.2，全長(zhǎng)約8 kb，含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。膜聯(lián)型EPCR(mEPCR)在金屬蛋白酶的作用下從內(nèi)皮細(xì)胞表面脫落形成可溶型EPCR(sEPCR)，脫落入血的sEPCR仍保留與PC/活化蛋白C(APC)結(jié)合的能力，其可通過(guò)與mEPCR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PC/APC，從而抑制mEPCR的功能[14]。研究發(fā)現(xiàn)EPCR存在多種基因突變，變異的EPCR基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)APC的細(xì)胞保護(hù)和抗凝血作用從而影響膜聯(lián)型EPCR(mEPCR)及sEPCR的表達(dá)[4，15]。

人類(lèi)EPCR基因型可分為三種：A1、A2和A3[16]。攜帶A3單倍體型雖然與冠心病、腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有影響[17]，但與深靜脈血栓形成[5]、女性特發(fā)性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[18]等疾病有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)所選的EPCR rs867186A/G屬于A3單倍體型，攜帶rs867186-AG基因型的患者更易發(fā)生靜脈血栓形成[19]， rs867186-GG基因型是重癥瘧疾患者的保護(hù)因素[20]。

本研究結(jié)果表明，兩組EPCR基因 rs867186位點(diǎn)的基因型和等位基因分布趨勢(shì)相同,攜帶rs867186 A等位基因的男性患膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)較高，提示EPCR基因多態(tài)性可能與膿毒癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)；對(duì)照組及膿毒癥組間EPCR基因多態(tài)性與血漿sEPCR的表達(dá)水平無(wú)關(guān)，提示膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與sEPCR水平的高低可能無(wú)明顯的關(guān)聯(lián)，與其他研究結(jié)果意見(jiàn)相似[21,22]。也有的研究表明患者血漿sEPCR水平在膿毒癥中升高[4]，或者減少[23]。這種差異的形成可能是因?yàn)闄z測(cè)血漿sEPCR濃度的方法不同，或?qū)嶒?yàn)研究對(duì)象所處的種族、區(qū)域不同。同時(shí)，我們的研究結(jié)果也提示了膿毒癥的病情輕重并不受rs867186A/G基因多態(tài)性的影響。

綜上所述，膿毒癥患者外周血EPCR基因rs867186A/G位點(diǎn)上多為AA型基因或攜帶等位基因A。EPCR基因rs867186A/G位點(diǎn)多態(tài)性可能與膿毒癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)。

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Polymorphism of endothelial protein C receptor gene rs867186A/G in patients with sepsis

LIANGYanbing,QINYueqiu,JIANGYujie,HUANGXia,LIJun,PENGDingwei,HUANGYuqing,LIAOPinhu

(AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China)

Objective To observe the polymorphism of endothelial protein C receptor (EPCR) gene rs867186A/G in the peripheral blood of patients with sepsis. Methods Sixty-four patients with sepsis (sepsis group, male 38, female 26) and 113 healthy subjects (control group) were selected. We collected 5 mL peripheral blood samples from both the observation group and the control group. The polymorphisms of EPCR gene rs867186A/G in the peripheral blood were observed, and serum soluble EPCR (sEPCR) of two groups was measured by ELISA. Meanwhile, we investigated the effect of EPCR gene rs867186A/G polymorphisms on plasma sEPCR level and sepsis severity. Results The frequencies of AA, AG and GG genotypes and A ,G alleles were 81.2%, 17.2%, 1.6%, 89.8% and 10.2% respectively, in sepsis group, versus 83.2%, 16.8%, 0, 91.6% and 8.4% in control group, and there was no significant difference in frequency distribution of the above genotypes and alleles of two groups (allP>0.05). Males carrying rs867186 A allele of EPCR gene were associated with a significantly increased risk of sepsis than women carrying the same alleles (OR=1.735, 95%CI: 1.063-2.833,P<0.05). The plasma sEPCR level in the sepsis group was slightly higher than that in the control group but no significant difference was found (allP>0.05). There was no significant difference in plasma sEPCR level and severity of sepsis between patients with different rs867186A/G genotypes (allP>0.05). Conclusions The AA genotype or A allele is more frequently found in EPCR gene rs867186A/G in the peripheral blood of patients with sepsis. The polymorphism of EPCR gene rs867186A/G may be associated with the increased risk of sepsis.

sepsis; endothelial protein C receptor; gene polymorphism

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560321)；2014年廣西醫(yī)學(xué)高層次骨干人才培養(yǎng)"139"計(jì)劃培養(yǎng)人選項(xiàng)目；廣西高校急重癥分子免疫研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(yy2015ky002)；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(YCSZ2015222)。

梁燕冰(1993-)，女，碩士研究生在讀，主要研究方向?yàn)槟摱景Y基因?qū)W機(jī)制。E-mail: 1067532076@qq.com

廖品琥(1967-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)槟摱景Y和ARDS。E-mail: liaopinhu@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.007

R446.11

A

1002-266X(2017)19-0025-04

2016-12-15)