李紅榮，張耀剛，呂彩霞，王香林，莊文婷，李建華

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，西寧810016；2青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖學(xué)教研室；3甘肅武威腫瘤醫(yī)院)

青海省漢族PIH患者血漿EPO水平及EPO基因3′端低氧增強(qiáng)子區(qū)T3541G單核苷酸多態(tài)性觀察

李紅榮1，張耀剛1，呂彩霞3，王香林1，莊文婷1，李建華2

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，西寧810016；2青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖學(xué)教研室；3甘肅武威腫瘤醫(yī)院)

目的 觀察青海省漢族妊娠高血壓(PIH)患者促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因3′端低氧增強(qiáng)子上T3541G單核苷酸多態(tài)性。方法 124例PIH患者為觀察組，112例正常孕婦為對(duì)照組。抽取兩組外周靜脈血，采用ELISA法檢測(cè)兩組血漿EPO。采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)方法對(duì)兩組EPO SNP/T3541G進(jìn)行基因型分型并測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果 觀察組和對(duì)照組血漿EPO水平分別為(454.113±35.097)、(396.316±50.262)pg/mL，二者比較，P<0.05。觀察組 EPO T3541位點(diǎn)基因型頻率野生型(TT)、雜合子型(TG)和突變純合子型(GG)分別為9.7%、74.2%、16.1%、對(duì)照組分別為42.9%、46.4%、10.7%，兩組比較，P均<0.05。觀察組EPO T3541位點(diǎn)等位基因頻率T、G分別為46.8.%、53.2%，對(duì)照組分別為66.1%、33.9%，兩組比較，P均<0.05)。EPO 基因SNP/T3541G多態(tài)性與PIH呈正相關(guān)(OR為0.451，95%CI：0.311～0.655)，T等位基因?yàn)镻IH的保護(hù)基因(OR為0.708，95%CI：0.602～0.833)，G等位基因?yàn)镻IH的危險(xiǎn)因素(OR為1.569，95%CI：1.263～1.949)。結(jié)論 青海省漢族PIH患者血漿EPO水平高于健康孕婦。EPO基因SNP/T3541G多態(tài)性與PIH有關(guān)。

妊娠并發(fā)癥；妊娠高血壓；子癲前期；促紅細(xì)胞生成素基因；單核苷酸基因多態(tài)性

妊娠高血壓(PIH)是產(chǎn)科的常見(jiàn)疾病，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因，國(guó)外報(bào)道發(fā)病率7%～12%、我國(guó)為9.4%、我國(guó)高原地區(qū)為24.6%、青海省為15%[1～3]。目前研究認(rèn)為PIH的發(fā)病與遺傳、母胎免疫失衡、胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞缺血、氧化應(yīng)激有關(guān)[4]，但其具體發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，PIH患者體內(nèi)存在缺血缺氧的病理?yè)p害。促紅細(xì)胞生成素(EPO)可作用于骨髓造血系統(tǒng)，促進(jìn)紅細(xì)胞的增殖分化，人體中主要由腎臟產(chǎn)生。近年研究發(fā)現(xiàn)其作為新的促血管生成因子，具有促進(jìn)血管生成、抵抗細(xì)胞凋亡、抗缺氧等多種生物學(xué)功能。缺氧環(huán)境下，缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)可調(diào)控EPO基因大量表達(dá)[5]。EPO基因3′端低氧增強(qiáng)子區(qū)域存在一個(gè)SNP位點(diǎn)(T3541G)，其多態(tài)性與EPO表達(dá)有關(guān)。在妊娠期母體血清、蛻膜、絨毛、胎肝、胚胎腦組織中EPO呈高表達(dá)[6]。目前關(guān)于EPO基因 SNP/T3541G多態(tài)性和PIH的相關(guān)性方面的報(bào)道較少。青海省大部分地區(qū)屬于高原，空氣中氧分壓低，而妊娠使孕婦對(duì)氧的需求量增加，相對(duì)于平原地區(qū)，高原孕產(chǎn)婦表現(xiàn)為胎盤(pán)灌注不足，胎盤(pán)缺血缺氧。在缺氧環(huán)境中，機(jī)體通過(guò)上調(diào)EPO來(lái)提高機(jī)體攜氧能力，改善組織缺血缺氧。本研究觀察了青海省漢族PIH患者血漿EPO水平變化及EPO基因 SNP/T3541G的多態(tài)性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年10月～2016年1月間西寧市各大醫(yī)院(青海省人民醫(yī)院、青海大學(xué)附屬醫(yī)院、西寧市第二人民醫(yī)院等)收治的PIH患者124例，年齡23～35(28.6±5.8)歲，紅細(xì)胞數(shù)(4.06±0.46)×1012/L ，血紅蛋白(121.31±14.24)g/L，均來(lái)自青海省漢族世居人群，符合 1996 年美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)(ACOG)提出的PIH分類方法與診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，排除妊娠前患有高血壓、糖尿病、腎病等慢性病。另隨機(jī)選取產(chǎn)前體檢正常的孕婦112例為對(duì)照組，年齡21～32(26.4±2.2)歲，紅細(xì)胞數(shù)(4.12±0.35)×1012/L ，血紅蛋白(123.71±12.85)g/L;均來(lái)自青海省漢族世居人群。兩組性別、年齡、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白等資料具有可比性。

1.2 血漿EPO檢測(cè) 抽取兩組外周靜脈血2 mL，采用ELISA法檢測(cè)兩組血漿EPO。所有操作步驟均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。重復(fù)3次，取平均值。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.3 EPO 基因SNP/T3541G多態(tài)性觀察 用EDTA管采集兩組患者外周靜脈血2 mL，使用基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司生產(chǎn))提取全血基因組DNA。參考文獻(xiàn)[7]合成EPO基因 SNP/T3541G位點(diǎn)引物(上游引物5′-ACTCTTGGCTTTTCTGTTTTCTGGG -3′和下游引物5′-TACT-GCGGTGAGGCCTTGAATGTAG-3′)。EPO SNP/T3541G多態(tài)性檢測(cè)采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)法，所用內(nèi)切酶為AccI(New England Biolabs，Beverly，MA)。PCR總反應(yīng)體積20μL：2×Taq PCR Master Mix10μL(天根生化科技有限公司生產(chǎn))， ddH2O 6 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，95 ℃、30 s，58 ℃、40 s，72 ℃、45 s，共32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min 。PCR 產(chǎn)物為226 bp。取PCR 產(chǎn)物8 μL用AccI 內(nèi)切酶 1μL，10×Tag Buffer 5 μL,ddH2O 6 μL,總體積20 μL，離心混勻后經(jīng)37 ℃水浴鍋消化5 h，酶切產(chǎn)物經(jīng) 4%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物被AccI 切為小片斷(201 bp 和 25 bp)，基因型為T(mén)T型，如果發(fā)生突變，AccI將不能切斷 PCR 產(chǎn)物。酶切產(chǎn)物為一個(gè)條帶(226 bp)，基因型為GG型。酶切產(chǎn)物為三條帶(226、201和25 bp)基因型為T(mén)G型。AccI的識(shí)別位點(diǎn)為5′…GT▼MKAC…3′，3′…CAKM▼TG…5′。K為G或T，M為A或C。將對(duì)照組和觀察組基因型為T(mén)T、TG、GG型的PCR產(chǎn)物樣品各2份送上海生物工程有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿EPO水平比較 觀察組和對(duì)照組血漿EPO水平分別為(454.113±35.097)、(396.316±50.262)pg/mL，二者比較，P<0.05。

2.2 兩組EPO基因SNP/T3541G等位基因及基因型頻率比較 兩組EPO 基因SNP/T3541G等位基因及基因型頻率比較見(jiàn)表1。相關(guān)性分析顯示，EPO 基因SNP/T3541G多態(tài)性與PIH呈正相關(guān)(OR為0.451，95%CI：0.311～0.655，P<0.05)，T等位基因?yàn)镻IH的保護(hù)基因(OR為0.708，95%CI：0.602～0.833)，G等位基因?yàn)镻IH的危險(xiǎn)因素(OR為1.569，95%CI：1.263～1.949)。

表1 兩組EPO 基因SNP/T3541G等位基因及基因型頻率比較(%)

注：與對(duì)照組相比，▲P<0.05。

3 討論

EPO是具有多種活性的血管因子，在心腦血管疾病中具有血管保護(hù)作用[8]；在腫瘤患者體內(nèi)，EPO可調(diào)節(jié)瘤體血管生成。人類EPO基因定位于7q22，其3′端增強(qiáng)子上3 512 bp～3 740 bp之間有HIF-1和其它因子的結(jié)合部位，如肝核因子、雌激素等。許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在這個(gè)部位，可提高EPO基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平[9]。有研究表明，把低氧反應(yīng)增強(qiáng)子通過(guò)載體轉(zhuǎn)染至Hep3B等細(xì)胞，可在低氧或CoCl2刺激下大量表達(dá)EPO基因[10,11]。最新研究發(fā)現(xiàn),在妊娠過(guò)程中，EPO具有促進(jìn)胎盤(pán)血管生成，改善胎盤(pán)血管功能的作用；可調(diào)控胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、凋亡，完成子宮螺旋動(dòng)脈重鑄及胎盤(pán)血管新生，維持母胎界面平衡，保證胎盤(pán)正常血供和營(yíng)養(yǎng)支持[12]。

EPO與PIH的相關(guān)性國(guó)內(nèi)外早有報(bào)道[13～15]，在PIH患者的胎盤(pán)、血液、臍帶血中EPO水平明顯增高。本研究發(fā)現(xiàn)，在青海省漢族PIH組中，突變雜合子TG及突變純合子GG基因型頻率明顯高于對(duì)照組。T等位基因頻率低于對(duì)照組，但G等位基因頻率明顯高于對(duì)照組。EPO基因SNP/T3541G與PIH呈正相關(guān)，G等位基因是PIH的危險(xiǎn)因素。EPO基因是受HIF基因調(diào)控的缺氧誘導(dǎo)通路主要調(diào)控基因。在缺氧的條件下，HIF基因高表達(dá)，作用于低氧調(diào)控區(qū)使EPO表達(dá)上調(diào)十倍左右，從而使機(jī)體內(nèi)紅細(xì)胞和血紅蛋白濃度升高，改善機(jī)體缺氧狀態(tài)。HIF在妊娠絨毛和蛻膜組織中表達(dá)增強(qiáng)，可誘導(dǎo) EPO合成增加[16]，EPO促進(jìn)血管生成和抗凋亡，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育。原因可能為EPO通過(guò)下調(diào)NF-κB的表達(dá)從而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)活化通路，活化的 NF -κB 通過(guò)與相應(yīng)的炎癥介質(zhì)靶基因啟動(dòng)子區(qū)的κB 位點(diǎn)相結(jié)合而導(dǎo)致炎癥介質(zhì)相關(guān)基因的過(guò)度表達(dá)，因此EPO可通過(guò)抑制NF-κB來(lái)抑制TNF-ɑ介導(dǎo)的炎癥因子釋放，另外，EPO可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)eNOS的合成，使NO合成增多，血管擴(kuò)張，改善胎盤(pán)血液供應(yīng)，從而對(duì)胎盤(pán)產(chǎn)生保護(hù)作用[17]。

研究報(bào)道，EPO基因T3541G位點(diǎn)突變型TG和GG型較野生型TT型相比，可促進(jìn)EPO表達(dá)[18,19]。如在藏族紅細(xì)胞增多患者中以TG型多見(jiàn)。這與本研究結(jié)果一致，PIH患者EPO基因T3541G位點(diǎn)突變以TG型多見(jiàn)，血漿EPO水平明顯高于正常孕婦。對(duì)藏豬EPO基因的多態(tài)性研究[20]認(rèn)為隨著海拔增高，藏豬的突變型基因頻率增高可能與高原低氧環(huán)境適應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，青海省漢族PIH患者血漿EPO水平高于健康孕婦。EPO基因SNP/T3541G多態(tài)性與PIH有關(guān)。但本研究樣本量相對(duì)較少，且沒(méi)有具體檢測(cè)不同基因型對(duì)EPO表達(dá)的影響，只是比較了兩組血漿EPO水平。今后研究應(yīng)將EPO增強(qiáng)子區(qū)T3541G不同基因型的基因通過(guò)載體導(dǎo)入到相應(yīng)細(xì)胞中，區(qū)分其對(duì)EPO表達(dá)的影響，為EPO基因多態(tài)性與妊高征的相互作用提供有力證據(jù)。

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青海省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015-ZJ-746)。

李建華(E-mail: lijianhua@qhu.deu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.017

R714.26

B

1002-266X(2017)19-0057-03

2017-01-19)