張震，齊曉敏，張薇，張培，曹旭晨，肖春花

(1天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津300060；2天津市“腫瘤防治”重點實驗室；3天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心；4乳腺癌防治教育部重點實驗室)

Matrigel三維細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞生長情況及對阿霉素敏感性觀察

張震1,2,3，齊曉敏1,2,3，張薇1,2,3，張培1,2,3，曹旭晨1,2,3，肖春花1,2,3

(1天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津300060；2天津市“腫瘤防治”重點實驗室；3天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心；4乳腺癌防治教育部重點實驗室)

目的 觀察Matrigel三維細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞生長情況及其對阿霉素的敏感性。方法 分別采用二維單層培養(yǎng)法、Matrigel三維細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)原代乳腺癌細(xì)胞。在培養(yǎng)的第1、3、5、7天，采用Olympus Ⅸ70倒置顯微鏡觀察二維單層培養(yǎng)及三維培養(yǎng)條件下的原代乳腺癌細(xì)胞形態(tài)， 采用CellTiter-Glo?發(fā)光法觀察細(xì)胞生長增殖情況及其對阿霉素的敏感性，繪制原代乳腺癌細(xì)胞生長曲線及藥敏曲線。結(jié)果 二維單層培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞貼壁生長，癌細(xì)胞聚集成巢狀，呈多種形態(tài)。三維細(xì)胞培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞聚集成緊密的多腫瘤細(xì)胞微球。二維單層培養(yǎng)第1、3、5、7天原代乳腺癌細(xì)胞的增殖倍數(shù)分別為1.00±0.00、1.39±0.29、2.08±0.25、3.26±0.41；三維培養(yǎng)第1、3、5、7天原代乳腺癌細(xì)胞的增殖倍數(shù)分別為1.00±0.00、1.25±0.08、1.79±0.10、1.58±0.02。隨阿霉素濃度升高，二維單層培養(yǎng)及三維培養(yǎng)下的原代乳腺癌細(xì)胞增殖抑制率增高。但三維細(xì)胞培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞增殖抑制率均低于二維細(xì)胞培養(yǎng)。結(jié)論 Matrigel三維細(xì)胞培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞可聚集成緊密的球形，細(xì)胞增殖速度變慢，對阿霉素的敏感性降低。Matrigel三維細(xì)胞培養(yǎng)原代乳腺癌細(xì)胞效果較好。

乳腺腫瘤；乳腺癌；Matrigel三維細(xì)胞培養(yǎng)方法；細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞增殖；藥物敏感性

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，病死率占女性癌癥死亡原因的15%[1]。對腫瘤組織進(jìn)行藥物敏感性檢測，根據(jù)檢測結(jié)果對患者進(jìn)行個體化用藥是目前的研究熱點。二維單層細(xì)胞培養(yǎng)是傳統(tǒng)的藥物敏感性檢測方法。人體組織和器官是以三維結(jié)構(gòu)的形式存在并發(fā)揮功能。研究[2～4]證實，與人體組織中三維結(jié)構(gòu)細(xì)胞相比，二維環(huán)境中培養(yǎng)形成的單層細(xì)胞的組織特異性結(jié)構(gòu)、生物學(xué)行為、細(xì)胞間及細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的相互作用明顯缺失。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是通過讓細(xì)胞聚集成細(xì)胞球或?qū)⒓?xì)胞包裹到在成分及結(jié)構(gòu)上類似于實體組織的細(xì)胞外基質(zhì)中，一定程度模擬了細(xì)胞在生物體內(nèi)的生存狀態(tài)[5, 6]，目前已經(jīng)被用于腫瘤細(xì)胞系的生長及耐藥性研究中[7～9]。關(guān)于三維環(huán)境下培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞的生長情況、藥物敏感性方面的相關(guān)報道較少。本研究觀察了Matrigel三維細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)、增殖及藥物敏感性變化?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與材料 乳腺癌組織取自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除并病理確診的乳腺癌標(biāo)本，患者術(shù)前均未經(jīng)過放化療，DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉、HEPES、Ⅰ型膠原酶、0.25%胰酶均購自美國Gibico公司，胎牛血清購自蘭州百靈公司，表皮生長因子購自R&D systems公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，CellTiter-Glo?發(fā)光法檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 原代乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立及純化 取適量乳腺癌組織，用無菌手術(shù)剪刀將組織剪碎至1 mm3，PBS沖洗，棄上清，加入2% Ⅰ型膠原酶，37 ℃孵箱消化15 h。取消化后的組織，40 g 離心1 min，取上清，100 g離心2 min；棄上清，取下層沉淀用原代培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)。此時腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞混雜生長，腫瘤細(xì)胞呈巢狀分布。培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度70%左右時0.05%胰酶消化約8 min，棄上清，加入10%原代培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)差異消化1次，得到純度約70%的原代乳腺癌細(xì)胞，備用。

1.3 原代乳腺癌細(xì)胞的Matrigel三維細(xì)胞培養(yǎng)方法 在冰盒上用預(yù)冷槍頭緩慢吸取30 μL Matrigel基質(zhì)膠(4 ℃預(yù)冷過夜后解凍)，加入96孔板，37 ℃培養(yǎng)箱靜置30 min，使Matrigel凝固。取生長狀態(tài)良好的原代乳腺癌細(xì)胞，0.05%胰酶消化，原代培養(yǎng)基終止消化并反復(fù)吹打均勻，400目過濾網(wǎng)過濾3次，計數(shù)板行臺酚藍(lán)活細(xì)胞計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度至50 000/mL，吹打均勻后取100 μL細(xì)胞懸液，緩慢加入到凝固Matrigel基質(zhì)膠上。37 ℃孵育30 min。將Matrigel基質(zhì)膠與原代培養(yǎng)基按照體積比1∶10混合，輕柔混合均勻，將Matrigel-培養(yǎng)基混合物緩慢加至96孔板中。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2天更換1次上層Matrigel-培養(yǎng)基混合物，備用。

1.4 細(xì)胞生長情況觀察

1.4.1 原代乳腺癌細(xì)胞形態(tài)觀察 在培養(yǎng)第3天時，分別取“1.2”中原代乳腺癌細(xì)胞、“1.3”中三維培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞，采用Olympus Ⅸ70倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4.2 原代乳腺癌細(xì)胞增殖情況觀察 分別取“1.2”中純化的原代乳腺癌細(xì)胞、“1.3”中三維培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至20 000/mL，各取96孔板，鋪12個復(fù)孔。每孔取100 μL細(xì)胞懸液，加入100 μL原代培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在第1、3、5、7天，各取3個復(fù)孔采用CellTiter-Glo?發(fā)光法測量原代乳腺癌細(xì)胞的增殖倍數(shù)。取出CellTiter靜置至室溫，室溫靜置30 min后取細(xì)胞，棄上清，每孔加入100 μL 10% DMEM，加入100 μL CellTiter試劑，震蕩2 min使其充分反應(yīng)，靜置10 min，檢測RLU值(代表乳腺癌細(xì)胞增殖倍數(shù))，并繪制原代乳腺癌細(xì)胞生長曲線。

1.5 原代乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性檢測 分別取“1.2”中純化的原代乳腺癌細(xì)胞、“1.3”中三維培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞，取96孔板，分別將細(xì)胞分為A組、B組、C組、對照組，每組3個復(fù)孔，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。第2天向A、B、C組分別加入0.15 、1.5 、15 μg/mL的阿霉素，對照組加入100 μL原代培養(yǎng)基。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用Olympus Ⅸ70倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，采用CellTiter-Glo?發(fā)光法檢測不同患者來源的各組細(xì)胞增殖抑制率(代表原代乳腺癌細(xì)胞對其阿霉素的敏感性)，所有操作方法均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 原代乳腺癌細(xì)胞形態(tài) 在二維單層培養(yǎng)條件下，乳腺癌細(xì)胞貼壁生長，癌細(xì)胞聚集成巢狀，呈多種形態(tài)，包括梭形、多邊形、不規(guī)則形。三維環(huán)境中的乳腺癌細(xì)胞聚集成緊密的球形。見圖1。

注：A 原代乳腺癌細(xì)胞在二維單層培養(yǎng)條件下，細(xì)胞貼壁生長，呈梭形、多邊形、不規(guī)則形。B原代乳腺癌細(xì)胞在三維培養(yǎng)條件下，細(xì)胞聚集并增殖形成緊密的球形。

圖1 二維單層培養(yǎng)及三維培養(yǎng)條件下的原代乳腺癌細(xì)胞形態(tài)

2.2 原代乳腺癌細(xì)胞增殖情況比較 二維單層培養(yǎng)第1、3、5、7天原代乳腺癌細(xì)胞的增殖倍數(shù)分別為1.00±0.00、1.39±0.29、2.08±0.25、3.26±0.41；三維培養(yǎng)第1、3、5、7天原代乳腺癌細(xì)胞的增殖倍數(shù)分別為1.00±0.00、1.25±0.08、1.79±0.10、1.58±0.02。二維單層培養(yǎng)及三維培養(yǎng)條件下的原代乳腺癌細(xì)胞生長曲線見圖2。

圖2 二維單層培養(yǎng)及三維培養(yǎng)條件下的原代乳腺癌細(xì)胞生長曲線

2.3 原代乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性比較 二維和三維培養(yǎng)條件下原代乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)改變見圖3。納入乳腺癌標(biāo)本最終僅培養(yǎng)成功4例份。培養(yǎng)48 h各組細(xì)胞增殖抑制率比較見表2。

3 討論

在1983年，有學(xué)者[10]首次將體外藥物敏感實驗同患者對藥物的反應(yīng)進(jìn)行了前瞻性實驗，由于當(dāng)時的培養(yǎng)條件限制及患者例數(shù)的不足，藥敏實驗的假陰性率及假陽性率均較高。然而，人們對于腫瘤組織藥物敏感性檢測的探索從未停止，試圖通過體外藥敏結(jié)果指導(dǎo)患者的臨床用藥，進(jìn)行個體化治療，減少患者不必要的經(jīng)濟(jì)損失及健康損害。當(dāng)前，我們對藥物敏感性檢測主要基于兩種模式——二維條件下的細(xì)胞培養(yǎng)以及動物模型實驗。雖然動物實驗是公認(rèn)的體外藥敏檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其周期長和倫理問題等原因在預(yù)測患者藥物敏感性的應(yīng)用中受到限制。傳統(tǒng)的二維單層細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞在培養(yǎng)皿中貼壁生長，不能真正反映組織生理狀態(tài)下的復(fù)雜性，以此為基礎(chǔ)的細(xì)胞學(xué)功能試驗一定程度上錯誤的評估了組織的特異性應(yīng)答反應(yīng)。二維環(huán)境下的單層細(xì)胞主要是進(jìn)行細(xì)胞去分化的細(xì)胞增殖，喪失了細(xì)胞本來的功能[11,12]。相反，在三維環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞在細(xì)胞增殖、分化、形態(tài)及功能等方面表現(xiàn)出與體內(nèi)更高的相似性，從而替代一些動物實驗[13]，搭建了二維細(xì)胞培養(yǎng)與動物實驗之間的橋梁。

注：A 二維單層培養(yǎng)對照組細(xì)胞貼壁生長，呈多邊形、梭形；B 二維單層培養(yǎng)A組癌細(xì)胞匯合度低；C二維單層培養(yǎng)B組癌細(xì)胞大量死亡，僅有少量細(xì)胞存活，且細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞活力差；D二維單層培養(yǎng)中C組細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，失去細(xì)胞形態(tài)；E 三維培養(yǎng)對照組細(xì)胞聚集成球狀；F三維培養(yǎng)A組三維乳腺癌多細(xì)胞球的形態(tài)、大小及數(shù)量變化不明顯；G三維培養(yǎng)B組癌細(xì)胞球結(jié)構(gòu)變得松散，呈葡萄狀；H三維培養(yǎng)C組多細(xì)胞球結(jié)構(gòu)更加松散，細(xì)胞離散，可見細(xì)胞碎片。

圖3 二維和三維培養(yǎng)條件下原代乳腺癌細(xì)胞形態(tài)改變

表2 培養(yǎng)48 h各組細(xì)胞增殖抑制率比較

本研究構(gòu)建了原代乳腺癌細(xì)胞的二維單層培養(yǎng)及Matrigel三維培養(yǎng)的方法，原代乳腺癌細(xì)胞在三維環(huán)境中形成緊密的細(xì)胞球，生長緩慢。研究認(rèn)為，三維環(huán)境下細(xì)胞聚集成多腫瘤細(xì)胞微球體(MCTS)，處于快速增殖期的癌細(xì)胞位于微球體最外層，而微球體中心則出現(xiàn)缺氧及營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不充分，中心的細(xì)胞主要處于靜止期，甚至為壞死細(xì)胞[14]。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三維環(huán)境中細(xì)胞在初始階段緩慢增長，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)下降趨勢。我們認(rèn)為這是由于在三維環(huán)境中腫瘤細(xì)胞形成緊密的細(xì)胞球，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞增殖細(xì)胞球體積增大，處于多細(xì)胞球中心的細(xì)胞則由于缺少氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)生壞死，從而引起活細(xì)胞數(shù)減少。這與體內(nèi)的腫瘤組織中的微環(huán)境非常相似，尤其是在腫瘤發(fā)生的早期血管生成之前的階段，腫瘤組織中心的癌細(xì)胞處于缺血缺氧的狀態(tài)，營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣供應(yīng)不充分，代謝廢物排出障礙，局部微環(huán)境不適宜細(xì)胞生存，細(xì)胞生長緩慢甚至發(fā)生壞死，處于腫瘤組織與正常組織交界處的腫瘤細(xì)胞則生長最活躍。此外，對卵巢癌的31個細(xì)胞系進(jìn)行三維培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，三維環(huán)境下主要可以形成三種形態(tài)：大的致密球形、大的疏松球形、小的聚集物，且結(jié)構(gòu)不同可能影響細(xì)胞對藥物的敏感性。

本研究結(jié)果采用CellTiter-Glo?發(fā)光法進(jìn)行原代乳腺癌細(xì)胞的藥物敏感性檢測，比傳統(tǒng)的MTT法、CCK8法更靈敏，適用于二維單層細(xì)胞及三維細(xì)胞球。結(jié)果顯示，同傳統(tǒng)二維單層細(xì)胞培養(yǎng)條件相比，三維環(huán)境下原代乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性下降，表現(xiàn)出對阿霉素耐受性增加。Lee等[15]報道，1847AD、FUOV1、OV2008等細(xì)胞系在三維環(huán)境中對藥物耐受性增加，同時發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)環(huán)境下形成的多腫瘤細(xì)胞微球中，腫瘤細(xì)胞的分化程度與腫瘤組織相似性更高，認(rèn)為三維環(huán)境中的藥物敏感性檢測的實驗結(jié)果能更真實的反應(yīng)活體內(nèi)細(xì)胞的藥物耐受性。對于三維環(huán)境中腫瘤細(xì)胞對藥物耐受性增加的機(jī)制，目前還不是十分清楚，但是已經(jīng)引起了廣泛地關(guān)注，已有文獻(xiàn)報道可能同基因的改變、缺氧、細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控等有關(guān)[16]，其具體機(jī)制還有待后續(xù)進(jìn)一步研究探索。

綜上所述，Matrigel三維細(xì)胞培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞可聚集成緊密的球形，細(xì)胞增殖速度變慢，對阿霉素的敏感性降低。Matrigel三維細(xì)胞培養(yǎng)原代乳腺癌細(xì)胞效果較好。

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Growth of primary breast cancer cells cultured by Matrigel three-dimensional cell culture method and its sensitivity to adriamycin

ZHANGZhen1,QIXiaomin,ZHANGWei,ZHANGPei,CAOXuchen,XIAOChunhua

(1TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,NationalClinicalResearchCenterforCancer,Tianjin300060,China)

Objective To observe the growth of primary breast cancer cells cultured in Matrigel three-dimensional cell culture method and its sensitivity to adriamycin. Methods The primary breast cancer cells were cultured by two-dimensional monolayer culture and Matrigel three-dimensional cell culture methods. On the 1st, 3rd, 5th and 7th day of culture, Olympus IX70 inverted microscope was used to observe the morphology of primary breast cancer cells under the condition of two-dimensional monolayer culture and three-dimensional culture. CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay was applied to observe the cell proliferation and its sensitivity to adriamycin. Primary breast cancer cell growth curve and drug sensitivity curve were drawn based on the observation results. Results The primary breast cancer cells with two-dimensional monolayer culture were in adherent growth, and the cancer cells gathered like a nest, with a variety of forms. The primary breast cancer cells with three-dimensional cell culture gathered into close multi-tumor cell microspheres. The proliferation of primary breast cancer cells cultured by two-dimensional monolayer culture on the 1st, 3rd, 5th and 7th day was 1.00±0.00, 1.39±0.29, 2.08±0.25 and 3.26±0.41. The proliferation of primary breast cancer cells cultured by Matrigel three-dimensional cell culture was 1.00±0.00, 1.25±0.08, 1.79±0.10 and 1.58±0.02. With the increase of adriamycin concentration, the inhibition rate of proliferation of primary breast cancer cells increased under two-dimensional monolayer culture and three-dimensional culture. But the proliferation inhibition rate of primary breast cancer cells with three-dimensional cell culture was lower than that with two-dimensional cell culture. Conclusion The primary breast cancer cells with Matrigel three-dimensional cell culture can gather into close spheres, the cell proliferation rate slows down, and the sensitivity of adriamycin decreases. Matrigel three-dimensional cell culture is better for culturing primary breast cancer cells.

breast neoplasms; breast carcinama; Matrigel three-dimensional cell culture method; cell morphology; cell proliferation; drug sensitivity

中國醫(yī)學(xué)基金會腫瘤預(yù)防與科研項目(314.2222)。

張震(1990-)，男，碩士研究生在讀，主要研究方向為乳腺腫瘤外科。E-mail: zzhen2015@163.com

肖春花(1971-)，女，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要研究方向為乳腺腫瘤外科、乳腺疾病早期診斷及乳腺癌保乳手術(shù)和一期乳房重建手術(shù)。E-mail: xxcchh2002@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.005

R734.2

A

1002-266X(2017)19-0017-04

2016-10-18)