郭 威，郭曉軍，武紅敏，2，董麗華，朱寶成

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000；2.河北眾邦生物技術(shù)有限公司，河北保定 071000）

青貯用產(chǎn)纖維素酶菌株3X-10的產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化

郭 威1，郭曉軍1，武紅敏1，2，董麗華1，朱寶成1

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000；2.河北眾邦生物技術(shù)有限公司，河北保定 071000）

本試驗(yàn)旨在通過將單因素、Plackett-Burman（PB）篩選與響應(yīng)面分析3種方法相結(jié)合來優(yōu)化產(chǎn)纖維素酶菌株3X-10產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，PB試驗(yàn)確定了影響菌株芽孢產(chǎn)量的主要因素，最后通過響應(yīng)面法確定當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為67 h、接種量為7.00%、裝液量為61 mL/250 mL時(shí)菌株的芽孢產(chǎn)量達(dá)到最大，為3.22×109cfu/mL，較優(yōu)化前的8.07×108cfu/mL增加了2.99倍。

纖維素酶；芽孢桿菌；條件優(yōu)化

青貯飼料就是在新鮮飼草中加入青貯劑進(jìn)行厭氧發(fā)酵得到的飼料。青貯飼料添加劑可以通過調(diào)節(jié)青貯料內(nèi)微生物區(qū)系，調(diào)控青貯發(fā)酵進(jìn)程，促進(jìn)乳酸菌繁殖，將粗纖維與多糖分解，從而改善青貯飼料品質(zhì)（趙士萍，2016）。乳酸菌類添加劑在生物青貯劑中應(yīng)用最多，但由于乳酸菌添加劑不易保存，且不能降解纖維素，限制了其應(yīng)用。纖維素酶產(chǎn)生菌通過產(chǎn)生纖維素酶，降解飼料中難以利用的纖維素為單糖或雙糖等可溶性糖，為乳酸菌、酵母菌的發(fā)酵提供更多的糖分，從而有助于其在青貯中發(fā)揮自身有益作用，促進(jìn)青貯發(fā)酵。

芽孢具有較強(qiáng)的抗逆性，對(duì)其在不良環(huán)境中的存活具有重要作用，也有利于將芽孢桿菌加工成微生物菌劑。生長(zhǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等因素能夠影響芽孢的形成，但芽孢的形成并不是芽孢桿菌生活史必要的環(huán)節(jié)（張冬冬，2014）。所以產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件的優(yōu)化對(duì)于芽孢桿菌菌劑的產(chǎn)業(yè)化十分必要（孔少元，2016）。本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)合對(duì)產(chǎn)纖維素酶株菌B.methylotrophicus 3X-10進(jìn)行產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，以期為中試生產(chǎn)工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 B.methylotrophicus 3X-10，由大熊貓糞便中篩選得到。

1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%、葡萄糖1.0%、NaH2PO4·H2O 0.03%、MnSO4·H2O 0.02%、Na2HPO40.06%，pH值7.2～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.0%、NaH2PO4·H2O 0.03%、Na2HPO40.06%、MnSO4·H2O 0.02%，pH值7.2～7.4。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基參照微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（1999）配制。

1.3 種子液培養(yǎng) 活化菌株3X-10，將菌株接種于50 mL/250 mL種子培養(yǎng)基，于180 r/min、37℃搖床培養(yǎng)12 h后作為種子液。

1.4 發(fā)酵液培養(yǎng) 按6.0%接種量，將種子液接種到50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在180 r/min、37℃條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，測(cè)定芽孢產(chǎn)量。

1.5 單因素試驗(yàn) 以芽孢產(chǎn)量為測(cè)定指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)確定發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽。

1.6 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.1 Plackett-Burman試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以芽孢產(chǎn)量為測(cè)定指標(biāo)，通過 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選對(duì)芽孢產(chǎn)量影響較大的因素。對(duì)影響產(chǎn)芽孢的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、培養(yǎng)溫度、初始pH值、培養(yǎng)時(shí)間9個(gè)影響因素進(jìn)行篩選，另設(shè)2個(gè)虛擬列，以考察試驗(yàn)誤差，共12組試驗(yàn)。Plackett-Burman試驗(yàn)因素和水平設(shè)置及設(shè)計(jì)方案分別見表1和表2。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素及水平設(shè)置

1.6.2 最陡爬坡試驗(yàn) 最陡爬坡試驗(yàn)的起點(diǎn)設(shè)置在Plackett-Burman試驗(yàn)的較低水平，步長(zhǎng)和上升路徑根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)得到的3個(gè)主效應(yīng)因素的比例關(guān)系設(shè)定，最終確定最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因子的濃度范圍。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.6.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn) 菌株的產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件采用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，得到最優(yōu)試驗(yàn)條件，并進(jìn)行驗(yàn)證（彭靜珊等，2015）。利用Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理和分析Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)的設(shè)計(jì)結(jié)果（徐向宏和何明珠，2010）。

1.6.4 芽孢產(chǎn)量測(cè)定方法

芽孢產(chǎn)量=生物量×芽孢形成率；

生物量測(cè)定采用細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。芽孢形成率測(cè)定采用芽孢染色法（沈萍，1999）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源對(duì)菌株芽孢產(chǎn)量的影響 如圖1所示，當(dāng)碳源為玉米粉時(shí)，菌株3X-10的芽孢產(chǎn)量達(dá)到最高值，為1.70×109cfu/mL。因此，選取玉米粉為菌株3X-10的最佳碳源。

圖1 碳源對(duì)菌株3X-10芽孢產(chǎn)量的影響

2.1.2 氮源對(duì)菌株芽孢產(chǎn)量的影響 氮源對(duì)菌株芽孢產(chǎn)量的影響見圖2，當(dāng)?shù)礊辄S豆餅粉時(shí)，菌株3X-10的芽孢產(chǎn)量達(dá)到最高值，為1.52×109cfu/mL。因此，菌株3X-10的最適氮源選取黃豆餅粉。

圖2 氮源對(duì)菌株芽孢產(chǎn)量的影響

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株芽孢產(chǎn)量的影響 從圖3可以看出，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽選MgSO4·7H2O時(shí)，菌株芽孢產(chǎn)量達(dá)到1.61×109cfu/mL，同比其他無(wú)機(jī)鹽種類芽孢產(chǎn)量最大，故菌株3X-10的最適無(wú)機(jī)鹽被確定為MgSO4·7H2O。

圖3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株芽孢產(chǎn)量的影響

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果 以芽孢產(chǎn)量為測(cè)定指標(biāo)，對(duì)影響菌株培養(yǎng)基的重要因素進(jìn)行篩選（徐向宏和何明珠，2010），菌株芽孢產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果見表3，通過回歸分析，對(duì)于菌株3X-10進(jìn)行試驗(yàn)獲得多元一次回歸方程Y=12.82-0.46A-1.61B+0.52C+2.08E+5.65F-0.91G-2.33J+ 0.76K-1.10L，式中Y為芽孢產(chǎn)量預(yù)測(cè)值，A-L代表各因素編碼水平。Plackett-Burman試驗(yàn)各因素參數(shù)主效應(yīng)分析見表4，3X-10回歸模型的P值為0.0152（P＜0.05），由此說明株菌的模型在進(jìn)行試驗(yàn)的全部回歸區(qū)域內(nèi)具有較好的擬合性。同時(shí)得出菌株 3X-10的發(fā)酵時(shí)間 （P= 0.0221）、裝液量（P=0.0148）、接種量（P=0.0185）是主要影響因素，為后續(xù)爬坡路徑試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析試驗(yàn)提供依據(jù)。

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn) 只有在臨近最佳值的區(qū)域內(nèi)，響應(yīng)面擬合得出的方程才能最接近實(shí)際情況，因此有效的響應(yīng)面擬合方程必須建立在最佳值區(qū)域內(nèi)（賀強(qiáng)禮等，2016）。利用最陡爬坡試驗(yàn)測(cè)定影響菌株芽孢產(chǎn)量的3個(gè)主要因素的中心點(diǎn)。由表5可知，芽孢產(chǎn)量在發(fā)酵時(shí)間為60 h、裝液量為60 mL/250 mL、接種量為5.6%時(shí)達(dá)到最大值，因此以此作為Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素參數(shù)分析（菌株3X-10）

表5 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果 響應(yīng)面分析法是一種尋找多因子系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，其中Box-Behnken和Central Composite中心組合設(shè)計(jì)是兩種主要的響應(yīng)面分析法 （RSA）（Ghatnur，2015）。本研究采用 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法（Ghatnur，2015；Ji等，2015）進(jìn)行響應(yīng)面分析，Box-Benhnken具體因子水平和編碼值見表6，結(jié)果見表7。

表6 Box-Benhnken設(shè)計(jì)各因子及其編碼值

表7 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)用Design Expert 8.06軟件對(duì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面值進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表8，獲得芽孢產(chǎn)量對(duì)三主因素的二次多項(xiàng)式回歸方程為：Y= 31.96+1.20A+1.44B+0.044C-0.58AB-0.055AC+ 0.67BC-2.26A2-5.56B2-3.73C2，式中 Y為菌株3X-10芽孢產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值，A為接種量，B為發(fā)酵時(shí)間，C為裝樣量。

模型回歸P值為＜0.0001（P＜0.01），失擬項(xiàng)P值為0.0686＞0.05，說明回歸方程的顯著性和可靠性較高；因此模型可以用于菌株3X-10芽孢產(chǎn)量發(fā)酵優(yōu)化的理論分析和預(yù)測(cè)。另外，二次響應(yīng)面回歸模型的R2值為0.9876，說明回歸方程的擬合度較高，可用于芽孢產(chǎn)量的理論預(yù)測(cè)。

表8 3X-10菌株芽孢產(chǎn)量響應(yīng)面試驗(yàn)的方差分析

通過上述擬合回歸方程，通過Design Expert 8.06軟件分析得到相應(yīng)的響應(yīng)面分析圖和相應(yīng)的等高圖，即所選取的3個(gè)因素中各因素的交互作用見圖4～圖6。每個(gè)響應(yīng)面分別代表2個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)第3個(gè)變量保持在0水平。等高線圖越接近橢圓，說明這兩個(gè)因素之間的交互作用越顯著，反之，若等高線圖接近圓形則說明這兩個(gè)因素之間的交互作用不顯著（陳濤等，2014）。

圖4 接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)3X-10菌株芽孢產(chǎn)量交互影響的三維曲面圖和相應(yīng)等高線圖（裝樣量=0）

圖5 接種量和裝樣量對(duì)3X-10菌株芽孢產(chǎn)量交互影響的三維曲面圖和相應(yīng)等高線圖（發(fā)酵時(shí)間=0）

圖6 發(fā)酵時(shí)間和裝樣量對(duì)3X-10菌株芽孢產(chǎn)量交互影響的三維曲面圖和相應(yīng)等高線圖（接種量=0）

由此可知，發(fā)酵時(shí)間和裝樣量之間的交互作用最顯著，圖6的響應(yīng)面立體顯示的曲面頂點(diǎn)即為預(yù)測(cè)的菌株3X-10芽孢產(chǎn)量最大值，為32.20× 108cfu/mL，此時(shí)接種量為7.00%，發(fā)酵時(shí)間為67.20 h，取67 h，裝樣量為61.20 mL/250 mL，取61 mL/250 mL。對(duì)模型得出的產(chǎn)芽孢量最大值水平，進(jìn)行6批次發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)平均值分別為（31.80±0.13）×108cfu/mL、（25.20±0.08）× 108cfu/mL、（32.22±0.20）×108cfu/mL，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相差甚微，它們之間較好的吻合性顯示了各模型的精確性與可靠性。

3 討論

與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)相比，響應(yīng)面法優(yōu)化菌株的產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件，可以縮短試驗(yàn)用時(shí)，并且可以篩選理論上的最佳發(fā)酵條件（Chen等，2005）。此法可以在較短周期內(nèi)利用較少的試驗(yàn)次數(shù)高精準(zhǔn)地建立連續(xù)變量的曲面模型；還能對(duì)各影響因子水平及相互間的交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)（代志凱，2010）。王西祥等（2015）優(yōu)化了枯草芽孢桿菌NS178的產(chǎn)芽孢發(fā)酵工藝，優(yōu)化后菌落數(shù)和芽孢產(chǎn)率分別達(dá)到 34.50×108cfu/mL和 75.8%。Ben Khedher等使用響應(yīng)面法對(duì)蘇云金桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化（Ben Khedher等，2011）。印楊（2013）和劉清術(shù) （2013）分別對(duì)巨大芽孢桿菌RB10和1013進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)芽孢優(yōu)化，均獲得顯著效果，菌株1013的芽孢產(chǎn)量比基礎(chǔ)培養(yǎng)提高了3.35倍。Luisa等（2015）利用響應(yīng)面法對(duì)枯草芽孢桿菌菌株EA-CB0575產(chǎn)芽孢的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)基條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后芽孢產(chǎn)量達(dá)到8.78×109cfu/mL，相比優(yōu)化前增加了17.2倍，較Plackett-Burman試驗(yàn)增加了1.9倍。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)菌株3X-10產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為67 h，接種量為7%，裝液量為61 mL/250 mL時(shí)菌株的芽孢產(chǎn)量最大，優(yōu)化后菌株3X-10的芽孢產(chǎn)量比優(yōu)化前增加2.99倍，效果顯著。

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This study was conducted to optimize the spore production fermentation conditions of strain 3X-10 producing Cellulase using the methods of single factor and Plackett-Burman（PB）combining with response surface methodology.On the basis of single factor，PB was used to screen and determine the main influential factors，and spore producing conditions were optimized by response surface analysis.Finally，fermentation time 67 h，inoculum density 7.00%and loading volum 61 mL/250 mL were determined as the optimum fermentation conditions.After optimizing，spore yield of 3X-10 increased by 2.99 times（from 8.07×108cfu/mL to 3.22×109cfu/mL）.

Cellulase；Bacillus；optimization

S816.3

A

1004-3314（2017）10-0023-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171006

河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃農(nóng)業(yè)關(guān)鍵共性技術(shù)攻關(guān)專項(xiàng)（16226604D）；河北省技術(shù)創(chuàng)新引導(dǎo)計(jì)劃科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金專項(xiàng)（15C1303121015）；保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（16ZN007）；滄州市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（161201007D）